[发明专利]LILRA3基因敲入小鼠的打靶载体和LILRA3基因敲入小鼠的构建方法

说明书

本发明提供了LILRA3基因敲入小鼠的打靶载体和LILRA3基因敲入小鼠的构建方法，属于基因工程技术领域，所述打靶载体的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，采用本发明提供的打靶载体能够将LILRA3基因构建到小鼠体内。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及LILRA3基因敲入小鼠的打靶载体和LILRA3基因敲入小鼠的构建方法。

背景技术

在中国汉族人群中RA患者功能性LILRA3基因频率明显高于健康人，提示功能性LILRA3可能是RA的易感性因素，尤其在男性中有更强的相关性。早期ACPA阳性RA患者中，纯合型功能性LILRA3患者关节影像评分更高，功能性LILRA3可能加重疾病严重程度。已有体外实验证明LILRA3能够参与免疫调节，促进炎症发生。除MHC I类分子外，LILRA3的配体尚不明确，LILRA3功能研究受到限制。因此需要体内实验验证LILRA3在免疫调节中的作用。由于小鼠中不存在LILRA3同源基因，目前缺少基于动物实验的体内研究。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供LILRA3基因敲入小鼠的打靶载体和LILRA3基因敲入小鼠的构建方法，采用本发明提供的打靶载体能够将LILRA3基因构建到小鼠体内。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了LILRA3基因敲入小鼠的打靶载体，所述打靶载体的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

优选的，所述打靶载体的构建方法包括：将基因连入EGE载体中，得到打靶载体；所述基因具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

优选的，所述步骤3)连入的反应条件包括：将100ng EGE载体、500ng基因、2μL 10xDNA Ligase Buffer、1U DNA Ligase和18μL ddH₂O混合后在22℃下孵育10min。

本发明还提供了LILRA3基因敲入小鼠的构建方法，包括：

将上述技术方案所述的打靶载体导入小鼠受精卵中，得到F0小鼠；

将得到的F0小鼠与野生型小鼠杂交，得到携带LILRA3基因的杂合型小鼠；

将携带LILRA3基因的杂合型小鼠进行杂交，得到的纯合型小鼠为LILRA3基因敲入小鼠。

优选的，所述打靶载体的使用量为5～10pL。

优选的，利用Rosa-GT-F、Rosa-GT-R和Rosa26-Test(L)-R3引物判定小鼠的基因型；

所述Rosa-GT-F引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

所述Rosa-GT-R引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

所述Rosa26-Test(L)-R3的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

本发明提供了LILRA3基因敲入小鼠的打靶载体和LILRA3基因敲入小鼠的构建方法，所述打靶载体的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。打靶载体中的目的基因包含ROSA26基因的同源臂，通过同源重组的方式，将打靶载体上的目的基因定点转入ROSA26基因位点，使目的基因可稳定遗传。ROSA26基因几乎在所有组织中都能编码一种非必需的核RNA，且为外源基因的插入热点。ROSA26位点基因敲入技术可以非常有效地建立多用途的条件性转基因小鼠模型。采用本发明提供的打靶载体能够将LILRA3基因构建到小鼠体内。

附图说明

图1为打靶载体酶切验证结果；

图2为小鼠基因型的PCR鉴定结果；