[发明专利]一种抑制酵母提前絮凝因子产生的方法

说明书

本发明首先公开了一种密码子优化的木聚糖酶抑制剂的基因；然后公开了一种木聚糖酶抑制剂的氨基酸序列；接着公开了一种木聚糖酶抑制剂的表达载体；还公开了一种木聚糖抑制剂的表达方法；另外还公开了一种木聚糖酶抑制剂的分离纯化方法；最后公开了利用上述木聚糖酶抑制剂抑制酵母提前絮凝因子产生的方法。本发明将HVXI基因通过GAP启动子，在毕赤酵母（Pichia pastoris）X33中表达，通过对内切木聚糖酶活性的抑制筛选表达活性最高的转化子，确定初步分离纯化条件，探索应用于糖化过程，研究对PYF的抑制作用，为进一步将其应用于田间大麦或制麦过程中，降低大麦或麦芽中PYF因子的产生提供可行性思路。

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种抑制酵母提前絮凝因子产生的方法。

背景技术

中国是啤酒生产与消费大国，2018年我国啤酒产量达3812.2万千升，实现销售收入超过1600亿元，是食品工业的重要组成部分。酵母是啤酒酿造的根本和灵魂，影响啤酒生产过程的稳定性和啤酒质量。在啤酒正常发酵末期，酵母会从悬浮状态逐渐聚集成团，然后自然沉降，即酵母絮凝。酵母提前絮凝(Premature Yeast Flocculation,PYF)是指啤酒发酵过程中，酵母还没有将可利用的发酵性糖发酵完全就大量沉降了，啤酒表现为发酵残糖高，酒精度低，产生不良风味，同时，伴随易导致微生物侵染、CO2溶解率下降、SO2含量高、啤酒过滤困难、酵母不可重复利用及发酵过程不易控制。因而，即便在啤酒生产工业化控制非常成熟的今天，若啤酒酿造过程中出现PYF，也必会造成生产企业无法挽回的经济损失，据行业估计每年损失超过1亿元。

本世纪以来，随着自然环境污染、国际环境气候变化及恶劣天气增加，微生物污染导致的啤酒大麦麦芽品质下降，加剧了PYF的发生频率并相继引起世界啤酒集团和国内啤酒、麦芽集团的严重关注。啤酒大麦麦芽微生物污染严重，在制麦过程中微生物会分泌木聚糖酶降解大麦麦芽皮壳和胚乳细胞壁中主要成分阿拉伯木聚糖，产生不同分子量的阿拉伯木聚糖链，其中包括富含结合态阿魏酸 (Ferulic acid,FA)分子量在20-27kDa的PYF因子，导致PYF的发生。但由于制麦和酿造过程的复杂性，加之酵母絮凝影响因素的多样性等原因，科研人员对大麦麦芽导致的PYF作用机理等研究仍停留在推测和假说的层面。

近年来，国内外研究人员主要围绕“PYF因子是什么物质”而开展，进而确定了特定分子量、富含结合态FA的阿拉伯木聚糖可以导致PYF的发生，且其产生与大麦麦芽微生物污染有高度相关性，但对有效控制PYF因子产生的研究相对较少。

关于PYF的控制研究，从啤酒原料大麦的选择开始，尽量避免使用有病害的大麦，对于受潮大麦或是遭受恶劣环境的田间大麦也尽量避免用于生产制麦。此外，还可以多应用无壳大麦(裸大麦)品种，如CDC Freedom，CDC McGwire 等。对成品的大麦或麦芽，其PYF倾向性的控制方法主要有：

(1)制麦前，清洗大麦，减少微生物污染；保持制麦过程中通风，特别是浸麦断水阶段及发芽过程中，降低CO₂浓度，提高O₂含量，保持制麦车间空气清新度；

(2)糖化前，对麦芽进行湿粉碎，或是对成品麦芽进行水洗和烘干；

(3)PYF阳性(PYF+)与阴性(PYF-)麦芽的搭配使用：PYF+麦汁(占10％或25％)与PYF-麦汁搭配，会减轻PYF的严重性。有研究学者也指出，PYF+ 麦芽比例小于5％，完全没有问题；另高于50％的发酵7d的PYF+发酵液以3:1 与发酵3天的PYF-混合；提高发酵温度(10到12.5℃)，可使PYF+麦芽用量达40％。研究者史刚提出生产中避免使用高PYF值的麦芽，不同PYF值麦芽混合搭配使用，并确定青岛啤酒股份有限公司麦芽(或混合后麦芽)PYF值在85％～115％之间。