[发明专利]表达人源sting蛋白的猪源细胞的构建方法和应用

权利要求书

1.表达人源sting蛋白的猪源细胞的构建方法，包括以下步骤：

1)针对核苷酸序列如SEQ ID NO.1～5所示的sgRNA序列中的任意一条，设计引物，合成引物，退火，得到引物二聚体，将所述引物二聚体连入慢病毒CRISPR-Cas9载体，得到靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体；

2)提取无内毒素步骤1)所述靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体，得到无内毒素的靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体，将无内毒素的靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体与包装质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2混合，共转染293T包装细胞，收获慢病毒；

3)将步骤2)得到的慢病毒感染猪源细胞后在细胞培养液中培养，24小时后更换细胞培养液，加入puromycin或者hygromycin B进行筛选，筛选第一存活的细胞；

4)加入puromycin或者hygromycinB48小时后，消化细胞，以每孔1个细胞的密度接种于96孔板，使用完全培养液连续培养1～2周后，将细胞传代至12孔板；细胞长满后传代，传代同时取部分细胞提取核酸和蛋白，通过westernblot和DNA测序鉴定筛选出sting敲除猪源细胞；

5)将人源sting基因连入慢病毒表达载体，得到人源sting过表达病毒载体；将所述人源sting过表达病毒载体与包装质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2混合，共转染293T包装细胞，得到人源sting过表达慢病毒；

6)将步骤5)得到的人源sting过表达慢病毒感染步骤4)得到的sting敲除猪源细胞后在细胞培养液中培养，24小时后更换细胞培养液，加入puromycin或者hygromycinB进行筛选，筛选第二存活的细胞；

7)将步骤6)得到的第二存活的细胞，按照步骤4)对第二存活细胞进行操作，鉴定筛选出表达人源sting蛋白的猪源细胞；

所述步骤1)和步骤5)没有时间先后顺序的限定。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤1)所述退火的条件为：将引物稀释成100mM浓度，按照体积比为1:1，与含ATP的缓冲溶液混合，95℃孵育5min，降温。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤1)所述连入的方法为：使用T4连接酶将引物二聚体与经酶切后的慢病毒CRISPR-Cas9载体进行连接。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤2)所述无内毒素的靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体与包装质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2的混合比例为4:1:2或3:1:2或3:0.75:1.5；步骤5)所述人源sting过表达病毒载体与包装质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2的混合比例为4:1:2或3:1:2或3:0.75:1.5。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤2)和步骤5)所述共转染用试剂包括Fugene HD、Lipofectamine 2000或Lipofectamine 3000。

6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤2)所述慢病毒包括直接收获的慢病毒液，或经高速离心浓缩的慢病毒液；步骤5)所述人源sting过表达慢病毒包括直接收获的人源sting过表达慢病毒液，或经高速离心浓缩的人源sting过表达慢病毒液；所述高速离心条件为20000g/min高速离心1小时以上。

7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤3)和步骤6)中所述puromycin的终浓度为1～10g/ml，所述hygromycin B的终浓度为200～500g/ml。

8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤5)所述人源sting基因含有Flag标签。

9.权利要求1～8任一项所述构建方法构建得到的表达人源sting蛋白的猪源细胞。

10.权利要求1～8任一项所述构建方法得到的表达人源sting蛋白的猪源细胞或权利要求9所述表达人源sting蛋白的猪源细胞在研究Sting蛋白在猪源病毒感染过程中的作用中的应用。