[发明专利]表达人源sting蛋白的猪源细胞的构建方法和应用

说明书

本发明涉及表达人源sting蛋白的猪源细胞的构建方法和应用，属于细胞构建技术领域。本发明利用CRISPR‑Cas9载体构建猪源细胞Sting敲除细胞株，在此基础上利用慢病毒表达载体表达人源sting蛋白。本发明所述构建方法使用人源化Sting蛋白替换猪源细胞内源性sting蛋白，替换后所有针对人源sting蛋白的抗体和抑制剂、激活剂都可以猪源细胞中使用，对于研究Sting蛋白在猪源病毒感染过程中的作用具有广泛的应用。

技术领域

本发明涉及细胞构建技术领域，具体涉及表达人源sting蛋白的猪源细胞的构建方法和应用。

背景技术

Sting蛋白在抗病毒感染过程具有重要作用，针对Sting蛋白的抗体研发，特异性抑制剂、激活剂开发主要以人源Sting蛋白为靶标。由于猪源Sting蛋白与人源蛋白存在氨基酸序列的差异，这些针对人源蛋白开发的抗体、抑制剂和激活剂通常无法在猪源细胞上使用，严重制约了Sting蛋白的在猪源病毒感染中作用的研究以及Sting抑制剂、激活剂在抗猪源病毒感染作用的研究和应用。

发明内容

本发明的目的在于提供表达人源sting蛋白的猪源细胞的构建方法和应用。本发明所述构建方法使用人源化Sting蛋白替换猪源细胞内源性sting蛋白，替换后所有针对人源sting蛋白的抗体和抑制剂、激活剂都可以猪源细胞中使用，对于研究Sting蛋白在猪源病毒感染过程中的作用具有广泛的应用。

本发明提供了表达人源sting蛋白的猪源细胞的构建方法，包括以下步骤：

1)针对核苷酸序列如SEQ ID NO.1～5所示的sgRNA序列中的任意一条，设计引物，合成引物，退火，得到引物二聚体，将所述引物二聚体连入慢病毒CRISPR-Cas9载体，得到靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体；

2)提取无内毒素步骤1)所述靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体，得到无内毒素的靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体，将无内毒素的靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体与包装质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2混合，共转染293T包装细胞，收获慢病毒；

3)将步骤2)得到的慢病毒感染猪源细胞后在细胞培养液中培养，24小时后更换细胞培养液，加入puromycin或者hygromycinB进行筛选，筛选第一存活的细胞；

4)加入puromycin或者hygromycin B 48小时后，消化细胞，以每孔1个细胞的密度接种于96孔板，使用完全培养液连续培养1～2周后，将细胞传代至12孔板；细胞长满后传代，传代同时取部分细胞提取核酸和蛋白，通过western blot和DNA测序鉴定筛选出sting敲除猪源细胞；

5)将人源sting基因连入慢病毒表达载体，得到人源sting过表达病毒载体；将所述人源sting过表达病毒载体与包装质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2混合，共转染293T包装细胞，得到人源sting过表达慢病毒；

6)将步骤5)得到的人源sting过表达慢病毒感染步骤4)得到的sting敲除猪源细胞后在细胞培养液中培养，24小时后更换细胞培养液，加入puromycin或者hygromycin B进行筛选，筛选第二存活的细胞；

7)将步骤6)得到的第二存活的细胞，按照步骤4)对第二存活细胞进行操作，鉴定筛选出表达人源sting蛋白的猪源细胞；

所述步骤1)和步骤5)没有时间先后顺序的限定。

优选的是，步骤1)所述退火的条件为：将引物稀释成100mM浓度，按照体积比为1:1，与含ATP的缓冲溶液混合，95℃孵育5min，降温。

优选的是，步骤1)所述连入的方法为：使用T4连接酶将引物二聚体与经酶切后的慢病毒CRISPR-Cas9载体进行连接。