[发明专利]一种展示CyHV-2膜蛋白的重组杆状病毒及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种展示CyHV‑2膜蛋白的重组杆状病毒及其制备方法和应用，ORF25在杆状病毒表面的展示通过将ORF25的胞外区与杆状病毒AcMNPV gp64的信号肽和跨膜区进行融合表达来实现，重组杆状病毒为载体表达的ORF25融合蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO:3。本发明以截短的CyHV‑2糖蛋白ORF25为抗原基因，构建重组杆状病毒，成功将ORF25展示在病毒表面。用该重组病毒转导鲫鱼细胞，ORF25在鲫鱼细胞表达并展示在细胞表面。以该重组病毒作为CyHV‑2疫苗对异育银鲫进行浸泡免疫，攻毒试验表明该重组杆状病毒免疫可以对CyHV‑2感染提供83.3％的相对保护率。

技术领域

本发明属于病毒载体疫苗技术领域，具体地说，涉及一种展示CyHV-2膜蛋白的重组杆状病毒及其制备方法和应用。

背景技术

CyHV-2(鲤疱疹病毒2型)是感染异育银鲫引起疱疹病毒性造血器官坏死病的病原，春季和秋季是其致病的高发季节，死亡率可高达100％，近年来给我国的鲫鱼养殖业造成了严重的经济损失。CyHV-2是双链DNA病毒，基因组长达290kb，可编码150种蛋白，其中包括36种膜蛋白(Journal of virology 2013；87:2908-2922)。

疫苗免疫是控制病毒感染的重要手段。研究表明，针对CyHV-2的感染，灭活疫苗可以为异育银鲫提供71.4％的相对保护率(FishShellfish Immunology 2016；49:344-350)。酵母表达系统表达纯化的CyHV-2的囊膜蛋白ORF25,ORF25C和ORF25D可以作为亚单位疫苗，为异育银鲫提供抵抗CyHV-2感染的保护性免疫(FishShellfish Immunology 2015；47:1024-1031)。但是这些疫苗需要注射到鲫鱼体内，使用不够简便，保护率也不理想。

杆状病毒可以将外源蛋白通过gp64跨膜区展示在病毒颗粒表面、转导多种动物细胞并在转导细胞中表达所携带外源基因，还可以作为疫苗佐剂刺激动物免疫反应等特点，因此在动物疫苗的研究和生产领域有广泛的应用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种展示CyHV-2膜蛋白的重组杆状病毒及其制备方法和应用，利用杆状病毒展示外源蛋白、对异育银鲫细胞具有转导能力的特点，构建了一种展示CyHV-2膜蛋白的重组杆状病毒，主要目的是为防控CyHV-2的感染提供一种简单、经济、高效的疫苗。

其具体技术方案为：

一种展示CyHV-2膜蛋白的重组杆状病毒，ORF25在杆状病毒表面的展示通过将ORF25的胞外区与杆状病毒AcMNPV gp64的信号肽和跨膜区进行融合表达来实现，以重组杆状病毒为载体表达的ORF25融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。

一种展示CyHV-2膜蛋白的重组杆状病毒的制备方法，包括以下步骤：a.制备CyHV-2编码的ORF25胞外区基因片段；b.将上述基因片段克隆到表达载体，使ORF25胞外区与AcMNPV gp64的跨膜区融合表达；c.将上述表达质粒与线性化的Bacmid共转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒。具体为：

步骤1、从感染CyHV-2的组织匀浆中提取总DNA作为模板，以SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2为引物，扩增ORF25的胞外区基因片段。

步骤2、将获得的PCR产物用BamHI和EcoRI双酶切，克隆到pQBD表达载体，获得重组质粒pQBD-ORF25。

步骤3、用pQBD-ORF25和线性化的AcMNPV bacmid qBac-III共转染Sf9昆虫细胞，转染后5天收集P0代重组病毒。继续扩增，获得高滴度重组病毒。

步骤4、将重组杆状病毒稀释至滴度为4×10³TCID₅₀/mL，将2cm大小的异育银鲫放入其中浸浴2小时进行免疫。