[发明专利]双色荧光示踪胶质瘤干细胞微环境模型的制备方法

权利要求书

1.双色荧光示踪胶质瘤干细胞微环境模型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，

S1，体外培养GSCs；

S2，将具有嘌呤霉素抗性的慢病毒转染红色荧光蛋白(RFP)基因于GSCs；

S3，将稳定表达RFP的GSCs接种至全身表达绿色荧光蛋白(GFP)balb/c裸小鼠体内，构建双色荧光示踪异种移植瘤模型；

S4，将稳定表达RFP的GSCs与全身表达绿色荧光蛋白(GFP)balb/c裸小鼠骨髓细胞体外共培养，构建双色荧光示踪体外细胞共培养模型；

S5，荧光共聚焦显微镜下观察两种荧光细胞的相互作用。

2.根据权利要求1所述的双色荧光示踪胶质瘤干细胞微环境模型的制备方法，其特征在于，所述S1中，首先配制干细胞培养基，即添加有bFGF、EGF、B27细胞添加剂的DMEM/F12培养液，另需在培养液中加入谷氨酸、复合维生素、丙酮酸钠、非必须氨基酸或双抗中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的双色荧光示踪胶质瘤干细胞微环境模型的制备方法，其特征在于，所述S1中，干细胞培养过程中，进行干细胞传代培养，即将干细胞悬液离心，去除上清，加入Accutase消化液，孵育，将干细胞球吹打成单细胞悬液，离心去除上清，加入干细胞培养液悬浮细胞，CO2细胞培养箱中继续培养。

4.根据权利要求3所述的双色荧光示踪胶质瘤干细胞微环境模型的制备方法，其特征在于，所述S2中，将处于对数生长期的干细胞悬液离心，去除上清，Accutase消化液在细胞培养箱中孵育，移液枪轻柔吹打干细胞球成单细胞悬液，接种于孔板，同时加入PBS浓度梯度稀释的病毒液，混合均匀后放入细胞培养箱中；

慢病毒转染细胞24h左右换液，离心干细胞悬液，去除上清，加入新鲜干细胞培养液重悬干细胞，转染48h后荧光显微镜下观察细胞转染效率；

根据不同稀释浓度的病毒及细胞生长状态，选择最佳适宜稀释浓度进行转染；

荧光显微镜下观察细胞转染效率大于70-80％时，加入嘌呤霉素，以杀灭为转染细胞，使接近100％的细胞均表达RFP。

5.根据权利要求4所述的双色荧光示踪胶质瘤干细胞微环境模型的制备方法，其特征在于，所述S3中，选择4-6周龄的全身表达绿色荧光蛋白(GFP)balb/c雄性裸小鼠，水合氯醛溶液腹腔注射麻醉后，酒精消毒皮肤；

计数处于对数生长期的稳定表达RFP的GSCs，每只裸小鼠接种107个细胞，分别接种于小鼠颅内、腹腔及皮下；

致瘤成功后，活体动物成像仪下观察异种移植瘤。

6.根据权利要求5所述的双色荧光示踪胶质瘤干细胞微环境模型的制备方法，其特征在于，所述S3中，断颈处死荷瘤鼠，切去移植瘤，直接用OCT(optimalcutting temperaturecompound)包埋，冰冻保存；用冰冻切片机切片OCT包埋的移植瘤组织，并与荧光共聚焦显微镜下观察GSCs-RFP与表达GFP的间质细胞。

7.根据权利要求6所述的双色荧光示踪胶质瘤干细胞微环境模型的制备方法，其特征在于，所述S4中，取4-6周龄表达绿色荧光蛋白(GFP)balb/c裸小鼠，麻醉后断颈处死，离断小鼠股骨和胫骨并在乙醇中浸泡，无菌条件下剥离附着的皮肤、筋膜和肌肉；

用含1％双抗的PBS缓冲液冲洗后，切开股骨和胫骨干骺端；用注射器吸取部分胎牛血清的DMEM完全培养基，插入干骺端反复冲洗骨腔，直到骨透明为止；用完全培养基于CO2细胞培养箱中继续培养骨髓细胞；

分别计数GSCs-RFP与表达GFP的骨髓细胞，将GSCs与骨髓细胞按比例共培养于同一细胞培养皿中；荧光显微镜及活细胞工作站下观察两种细胞的相互作用。