[发明专利]双色荧光示踪胶质瘤干细胞微环境模型的制备方法

说明书

本发明公开了双色荧光示踪胶质瘤干细胞微环境模型的制备方法。该制备方法包括体外培养GSCs；将具有嘌呤霉素抗性的慢病毒转染红色荧光蛋白(RFP)基因于GSCs；将稳定表达RFP的GSCs接种至全身表达绿色荧光蛋白(GFP)balb/c裸小鼠体内，构建双色荧光示踪异种移植瘤模型；将稳定表达RFP的GSCs与全身表达绿色荧光蛋白(GFP)balb/c裸小鼠骨髓细胞体外共培养，构建双色荧光示踪体外细胞共培养模型；荧光共聚焦显微镜下观察两种荧光细胞的相互作用。本发明具有通过两种荧光分别标记胶质瘤干细胞与微环境中间质细胞，使二者在细胞层面上的相互作用，在荧光显微镜下可见，为体内体外肿瘤微环境的研究提供了一种有效的研究方法的效果。

技术领域

本发明涉及医疗生物标记技术领域，特别涉及双色荧光示踪胶质瘤干细胞微环境的制备方法。

背景技术

胶质瘤是颅内发病率最高的恶性肿瘤，约占中枢神经系统原发肿瘤的43％～50％。其中胶质母细胞瘤(glioblastoma，GBM)因常伴有对周围组织的侵袭和破坏，所以预后极差，中位生存期仅为14.6个月。胶质瘤干细胞(Glioblastoma stem cells，GSCs)及其微环境的相互作用是促进胶质瘤进展的重要因素。研究表明GSCs可诱导微环境中的间质细胞发生恶性转化，这可能是胶质母细胞瘤易复发的潜在因素。间质细胞发生恶性转化的可能性机制归纳如下：1)GSCs通过与微环境中间质细胞直接接触，直接诱导间质细胞发生恶变。2)胶质瘤微环境中GSCs可与间质细胞发生相互作用并发生细胞融合，从而使正常间质细胞具有了肿瘤细胞的恶性表型。3)GSCs可向胶质瘤微环境中释放外泌体，间质细胞通过吞噬这些外泌体使自身发生恶性转化。

胶质瘤在微环境研究的难点在于并不能直接观察GSCs与微环境中的间质细胞之间的相互作用。因此，建立双色荧光示踪GSCs微环境模型为分别示踪肿瘤细胞与间质细胞提供了可视化的研究平台，这对GBM发生发展的分子机制和肿瘤微环境等目前热议的研究方向具有重要意义。

发明内容

鉴于在胶质瘤微环境中，观察胶质瘤干细胞与肿瘤微环境中间质细胞之间相互作用存在困难，根据本发明的一个方面，提供了一种双色荧光示踪胶质瘤干细胞微环境的制备方法，此方法分别用两种荧光标记肿瘤干细胞与间质细胞，从而可直接观察二者之间的相互作用。

该双色荧光示踪胶质瘤干细胞微环境的制备方法至少包括以下步骤：

S1.体外培养GSCs

S2.将具有嘌呤霉素抗性的慢病毒转染红色荧光蛋白(RFP)基因于GSCs

S3.将稳定表达RFP的GSCs接种至全身表达绿色荧光蛋白(GFP)balb/c裸小鼠体内，构建双色荧光示踪异种移植瘤模型。

S4.将稳定表达RFP的GSCs与全身表达绿色荧光蛋白(GFP)balb/c裸小鼠骨髓细胞体外共培养，构建双色荧光示踪体外细胞共培养模型。

S5.荧光共聚焦显微镜下观察两种荧光细胞的相互作用。

上述的双色荧光示踪胶质瘤干细胞微环境的制备方法，其有益效果是，通过两种荧光分别标记胶质瘤干细胞与微环境中间质细胞，使二者在细胞层面上的相互作用，在荧光显微镜下可见。为体内体外肿瘤微环境的研究提供了一种有效的研究方法。

在一些实施方式中，S1中，首先配制干细胞培养基，即添加有浓度为20ng/mlbFGF，20ng/ml EGF，1×B27细胞添加剂的DMEM/F12培养液，另需在培养液中加入1×谷氨酸、复合维生素、丙酮酸钠、非必须氨基酸。双抗可根据具体情况选择性添加。