[发明专利]无标记血管紧张素Ⅱ受体细胞模型构建和筛选方法及应用

说明书

本发明涉及一种无标记血管紧张素Ⅱ受体细胞模型构建和筛选方法及应用，具体地说是涉及一种血管紧张素Ⅱ受体的亚型(AT1受体)，用无标记细胞动态质量重置技术在不同细胞系上进行模型建立，筛选和应用。本发明所述AT1受体模型在内源性表达AT1受体的A549和Hep G2细胞系上分别构建。该方法具有接近体内真实环境、无标记、实时监测、通量高、操作简单的特点，可以筛选具有AT1受体活性的配体，包括激动剂和拮抗剂，以及评价AT1受体拮抗剂的结合特点。

技术领域

本发明属于药理学研究及药物筛选研究领域，具体涉及血管紧张素Ⅱ受体的亚型，即AT1受体的在内源性细胞上的模型建立，本发明还涉及AT1受体的配体筛选方法和分析及应用。

背景技术

血管紧张素Ⅱ受体(AT1)属于G蛋白偶联受体中的视紫红质A类家族，主要分布于血管、肾脏、心脏、肾上腺和脑组织中。AT1受体主要通过与内源性配体血管紧张素Ⅱ作用，引起血管收缩、醛固酮和精氨酸加压素的释放、盐和水的重吸收、细胞的增殖和迁移等一系列反应，从而维持血压稳定等。而AT1受体的过度激活会导致血压升高和心肌肥厚。在最近的研究中，AT1受体系统对于血管重塑、动脉粥样硬化、心脏疾病和癌症等也有相关调节作用。

AT1受体的抑制剂是目前最常用的六大类降压药之一，有氯沙坦、缬沙坦、伊贝沙坦、替米沙坦等，它们选择性地作用于AT1受体，并不影响其它激素受体或心血管中重要的离子通道的功能，具有长效、高效、低毒等特点。此外，临床研究表明AT1受体抑制剂不仅能够有效降压，还可改善高血压并发症，逆转左室肥厚，保护肾功能，治疗心力衰竭等。对于高血压合并糖调节受损患者，AT1受体抑制剂氯沙坦较左旋氨氯地平可降低患者进展为2型糖尿病的风险。因此寻找并发现AT1受体抑制剂是新药开发人员的持续关注焦点。特别是新结构的AT1受体抑制剂的发现，将会打破非肽类AT1受体抑制剂结构单一的现状，为临床用药提供新鲜高效的候选药物。研究和发现AT1受体的配体在生命医学研究和药物发展上都有重要的意义(Burnier,M.,Brunner,H.R.(2000).Angiotensin II receptorantagonists.Lancet,355(9204),637-645；Burnier,M.,Maillard,M.(2001).Thecomparative pharmacology of angiotensin II receptor antagonists.BloodPressure,10,6-11；Shin-icbiro Miura,S.S.K.a.K.S.(2011).Angiotensin II type1receptor blockers class effects.Journal of the Renin-Angiotensin-AldosteroneSystem,12(1).)。

对于GPCR受体的模型构建和配体筛选方法，通常建立于转染细胞模型上。而对于内源性细胞，更多用于检测化合物对于细胞内功能因子，如白细胞介素，NF-κB等的影响。DMR技术的特点在于，可以使用内源性细胞对GPCR受体进行模型构建和配体筛选。DMR技术的原理是，将探针分子或待测分子与细胞受体结合后引起的细胞底部的质量变化，通过远程波导光栅芯片转化成光信号输出，从而在一定时间内实时监测信号升降，判断探针分子或待测分子与受体的结合情况。因此，在内源性细胞上得到的DMR信号可以覆盖更广泛的信号通路，也使得检测环境更接近生物体的真实环境。但是，由于受体在每个细胞内的表达量和功能状态都不相同，使得对于特定GPCR在DMR技术平台上的模型构建是需要研究的。本发明技术在以往研究的基础上，通过多种技术手段，发现A549细胞系和Hep G2细胞系都可以表达功能性的、可被DMR技术检测分析的AT1受体，能够用于AT1受体的模型构建和应用。

发明内容