[发明专利]一种水曲柳嫩绿半致密型愈伤组织诱导不定芽再生的方法

权利要求书

1.一种水曲柳嫩绿半致密型愈伤组织诱导不定芽再生的方法，建立下胚轴和茎段通过愈伤组织途径再生不定芽再生的方法，该方法特征如下：

(1)外植体来源：常规表面消毒，剥取成熟胚，经WPM培养至子叶展开时，切取下胚轴接种于a20培养基诱导愈伤组织及不定芽；切取株高3-5cm的水曲柳无菌苗两个芽点之间的无芽茎段接种于c12培养基诱导愈伤组织及不定芽；

(2)愈伤组织及不定芽诱导培养基：下胚轴a20培养基包含MS+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+5mg/L 6-BA+1mg/L TDZ；茎段c12培养基包含MSB5+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+5mg/L 6-BA+8mg/L TDZ+0.1mg/L IBA+2mg/L甘氨酸+5％椰子水，pH均为5.8；

(3)培养条件及诱导率：诱导材料经避光培养14d后转为光培养，光照强度80μmol*m^-2*s^-1、光16h/暗8h、温度25±2℃、湿度80％-90％；20d时愈伤组织诱导率：茎段为99.15％，下胚轴为88.69％；30d时不定芽诱导率：茎段为33.33％，下胚轴为10.52％；

(4)培养状态：下胚轴与茎段诱导形成的愈伤组织内部硬度适中、略松散，表面会形成一些小的深绿色凸起，团块间有空隙，利于新分裂和分化的细胞生存，从而形成芽原基，最终形成不定芽；

(5)下胚轴与茎段形成的愈伤组织比较：下胚轴形成的愈伤组织内部质地坚硬、生长速度较快、呈墨绿色、易老化；茎段形成的愈伤组织内外均一、质地较下胚轴略为松散、生长速度较慢、呈黄绿色，细胞团更为饱满，更有利于愈伤组织局部的物质积累，利于芽原基的形成，最终分化生长形成不定芽，不定芽多为丛生，且继代后生长状态良好，成活率高。