[发明专利]一种水曲柳嫩绿半致密型愈伤组织诱导不定芽再生的方法

说明书

本发明提供了一种通过诱导嫩绿半致密愈伤组织这个关键环节，从而实现下水曲柳下胚轴和茎段经愈伤组织途径的不定芽再生与繁殖的方法。从成熟胚培养至子叶展开(21d)时，切取下胚轴，接种于a20培养基中；从无菌苗切取茎段，接种于c12培养基中，经暗/光交替培养，获得嫩绿色半致密型愈伤组织，下胚轴和茎段愈伤组织诱导率分别为88.69％和99.15％，不定芽在愈伤组织块半致密缝隙处形成，诱导率分别为10.52％和33.33％。本发明解决了水曲柳经愈伤组织途径难以分化不定芽瓶颈环节，通过高效的愈伤组织诱导及有效的不定芽再生，为水曲柳快速繁殖技术奠定了坚实的基础。

技术领域：

本发明属于林木遗传育种领域，植物组织培养范畴，水曲柳高效繁殖技术

背景技术：

水曲柳种子具有生长间隔期长、深休眠、繁殖速度慢等特性，优良无性系及杂交优势种需20年左右才能进入成熟期，扦插嫁接无性繁殖技术受季节等因素限制，无法将优良子代大量扩繁，因此建立一个高效的繁殖技术尤为重要。2001年张慧君等对水曲柳芽、茎尖、种子等外植体诱导出苗培养进行了初步探索；2010年沈海龙等根据下胚轴尝试建立繁殖系统，但繁殖系数低且不稳定；2013年丁小萌等以水曲柳叶柄为外植体诱导得到水曲柳疏松愈伤组织；2018年梁雪等建立了水曲柳悬浮培养体系；水曲柳愈伤组织较容易通过诱导外植体获得，但是愈伤组织进行不定芽诱导分化技术的研究目前尚不成熟。本发明建立并优化一个高效的愈伤组织诱导与不定芽再生体系。

发明内容：

本发明提供了一种高效的愈伤组织诱导与不定芽再生的方法，具体内容包括：

1，通过四种水曲柳外植体(下胚轴、根、子叶、茎段)分别诱导愈伤组织和不定芽的再生，筛选得出水曲柳组培苗茎段为诱导愈伤组织及不定芽的最适外植体；

2，通过对比三种不同的培养基(WPM、MS、MSB5)对不定芽诱导率的影响，最终选出MSB5最佳培养基；培养条件：外植体经暗培养14d后转光培养(光照强度80μmol*m^-2*s^-1、光16h/暗8h、温度25±2℃、湿度80％-90％)20d时可诱导出嫩绿半致密型愈伤组织，30d诱导出丛生不定芽。

3，通过外源添加两种激素(6-BA、TDZ)的多种组合试验，观察并统计存活率，愈伤组织及不定芽诱导率，综合得出：下胚轴在a20(MS+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+5mg/L 6-BA+1mg/L TDZ)培养基、茎段在c12(MSB5+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+5mg/L 6-BA+8mg/L TDZ+0.1mg/LIBA+2mg/L甘氨酸+5％椰子水pH均为5.8)培养基上愈伤组织诱导率分别为88.69％和99.15％，不定芽诱导率分别为10.5％和33.33％。

本发明是水曲柳组培苗快速繁殖的关键技术之一，通过高效的愈伤组织诱导及有效的不定芽再生，填补了水曲柳无性繁殖领域中组培苗快速繁殖的研究空白，解决了水曲柳经愈伤组织途径难以分化不定芽的瓶颈环节，通过高效的愈伤组织诱导及有效的不定芽再生，为水曲柳快速繁殖技术奠定了坚实的基础。

附图说明：

图1下胚轴、根和子叶诱导愈伤组织及下胚轴再生不定芽

图2茎段诱导愈伤组织及其再生不定芽

具体实施方式：

1，水曲柳种子消毒及接种的具体步骤

将春化处理后的水曲柳种子剥去外种皮，流水冲洗24h后，于超净工作台内，经70％酒精处理30-45s，10％NaClO消毒15-20min，无菌水冲洗4次，剥出胚，接入含有30g/L蔗糖，7g/L琼脂的WPM培养基中培养。

2，水曲柳组培苗不同外植体的不定芽诱导培养基