[发明专利]一种生产异丁醇的运动发酵单胞菌重组菌株、构建方法及其应用

权利要求书

1.一种生产异丁醇的运动发酵单胞菌重组菌株，其特征在于：所述重组菌的基因组ZMO0038位点替换为抗性筛选标记基因、启动子基因片段以及KdcA基因；所述重组菌还转入了能够融合表达缬氨酸合成途径中的Als, ilvC, ilvD 基因的表达载体；

其中，kdcA基因序列见SEQ ID NO.1；

所述表达重组表达载体携带依次连接的启动子基因片段、Als基因、RBS基因、ilvC基因、RBS基因和ilvD 基因，Als的基因序列见SEQ ID NO.19，ilvC, ilvD 基因序列见SEQ IDNO.15和SEQ ID NO.16；

启动子基因片段为诱导型启动子Ptet或组成型启动子Pgap；

利用诱导型启动子或组成型启动子控制kdcA基因的表达和Als, ilvC, ilvD 基因的表达。

2.如权利要求1所述的一种生产异丁醇的运动发酵单胞菌重组菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：根据二羟酸脱氢酶基因kdcA基因序列设计引物，进行PCR扩增，获得目标片段；

步骤2：获取抗性筛选标记基因片段、启动子基因片段以及宿主菌目标片段插入位点上下游基因片段，所述插入位点为Z. mobilis ZM4基因组中的ZMO0038位点；

步骤3：将步骤1和步骤2获得的基因片段转入载体，并转化至ZM4感受态细胞，构建重组菌株。

3.根据权利要求2所述的一种生产异丁醇的运动发酵单胞菌重组菌株的构建方法，其特征在于：所述启动子为诱导型启动子Ptet或组成型启动子Pgap。

4.根据权利要求2所述的一种生产异丁醇的运动发酵单胞菌重组菌株的构建方法，其特征在于：步骤1中根据kdcA基因序列设计的引物序列见SEQ ID NO.2和见SEQ ID NO.3。

5.根据权利要求2所述的一种生产异丁醇的运动发酵单胞菌重组菌株的构建方法，其特征在于：步骤3中所述载体为pUC57载体。

6.如权利要求2所述的一种生产异丁醇的运动发酵单胞菌重组菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤a：获取Als, ilvC, ilvD 基因片段；

步骤b：将上述获取的三种基因片段整合至穿梭质粒pEZ15a中，构建重组质粒；

步骤c：将重组质粒转入权利要求4获得的重组菌株中。

7.如权利要求1所述的一种生产异丁醇的运动发酵单胞菌重组菌株在生产异丁醇中的应用。

8.利用权利要求2~6任一所述的一种生产异丁醇的运动发酵单胞菌重组菌株的构建方法构建的重组菌株在生产异丁醇中的应用。