[发明专利]一种生产异丁醇的运动发酵单胞菌重组菌株、构建方法及其应用

说明书

本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种生产异丁醇的运动发酵单胞菌重组菌株、构建方法及其应用。本发明以运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis ZM4为模式菌株，首先通过基因工程的手段对菌株进行改造，利用运动发酵单胞菌自身的缬氨酸合成途径中的中间代谢产物，引入二羟酸脱氢酶(KDCA)基因，实现对缬氨酸途径中2‑ketoisovalerate转换为异丁醇的前体isobutyraldehyde，然后在醇脱氢酶协助下生成异丁醇。其次，通过过表达L‑valine合成途径中的基因并筛选代谢途径中乙酰乳酸合酶达到增产的目的。最后通过调试代谢通路中不同基因的表达量，最终实现高产的目的。

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种生产异丁醇的运动发酵单胞菌重组菌株、构建方法及其应用。

背景技术

由于全球能源危机及化石能源引起的严重环境问题，环保、可再生的生物燃料引起了广泛的关注。随着合成生物学技术的发展和进步，利用微生物进行代谢工程改造和系统生物学研究受到越来越多的关注。以微生物为载体从廉价的可再生资源中生产生物燃料和增值化学品，为解决化石资源短缺及其引发的相关环境问题提供了有效的替代方案。近年来，通过代谢工程和合成生物学开发了多种可再生生物燃料的微生物。目前为止，生物乙醇是研究最多的生物基燃料并且木质纤维素乙醇生产已成功在多个国家进行商业应用。但是因乙醇有如高吸湿性、高挥发性和低能量密度等特性，限制了其在特定用途中的广泛应用。但是高级醇，如异丁醇等具有能量密度高、低吸湿性、低蒸气压以及高辛烷值等优点，并且可以作为异丁烯生产的前体，使其有希望成为现有化石燃料的替代品。

公布号为CN106755035A的中国发明专利披露了一种基于高效低残糖发酵异丁醇的大肠杆菌合成菌株构建方法，其构建了一株能够高效低残糖发酵异丁醇的大肠杆菌合成菌株，以45g/L初始葡萄糖浓度，30h完成发酵，异丁醇产量达到13.67g/L。

但是，上述构建的重组大肠杆菌属于好氧菌，其发酵过程属于严格好氧发酵，工业化生产成本较高。

运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）作为天然产乙醇菌株，具备独特ED代谢途径和较高的糖发酵效率，并且具有乙醇产量高、产生物量少、乙醇耐受力强、耐高渗透压等理想工业细胞工厂的特性，是目前构建生物燃料及其他生物及平台化合物的工程菌株的优选宿主之一。运动发酵单胞菌作为一种兼性厌氧生物，在厌氧条件下相对于有氧条件下表现更好，终产物更少，运动发酵单胞菌使用Entner-Doudoroff（ED）途径而不是Embden-Meyerhof-Parnas（EMP）途径进行糖酵解，ED途径较EMP途径少产生50％ATP，运动发酵单胞菌通过碳代谢以达到能量平衡，可有效提高代谢产物的产量和产率。模式菌株Z. mobilis ZM4的基因组序列已被确定，并且已通过系统生物学数据完善了它的基因组注释，其基因组仅为2-M，约有1700多个编码区，有利于基因组规模代谢网络建模和代谢工程实践。目前已经在Z. mobilis中实现了乳酸、琥珀酸、2-3丁二醇以及聚羟基丁酸（PHB）的尝试。此外，通过代谢工程研究改造，运动发酵单胞菌可将来自木质纤维素生物质作为发酵底物，使得运动发酵单胞菌具有很大前景。这些工作有助于更好地了解运动发酵单胞菌的应用和开发，以便作为更低成本、更高产和适合生化产品的平台，使其成为理想的细胞工厂。

公告号为CN102876625B的中国发明专利披露了一种产异丁醇的运动发酵单胞菌基因工程菌及其构建方法，其通过将2-酮异戊酸脱羧酶基因(kivd)和醇脱氢酶基因(adhA)构建至运动发酵单胞菌中，最终得到产量为0.1g/L的重组菌。

上述基于重组运动发酵单胞菌的生产异丁醇的方法，虽然由好氧发酵改进为了静置厌氧发酵；但是，其异丁醇的产量太低，仅为0.1g/L，无法满足工业化生产的要求。

发明内容