[发明专利]一种过氧化氢全细胞生物传感器及其制备与应用

权利要求书

1.一种过氧化氢全细胞生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建pCM-lux载体：

使用同源重组的方法将lux报告基因连接进入pCMgfp-lacZ质粒，构建pCM-lux载体；

(2)构建pCM-lux-PahpC载体：

使用同源重组的方法将恶臭假单胞菌Pseudomonas putida KT2440中ahpC基因的启动子PahpC连接进入pCM-lux质粒，构建pCM-lux-PahpC载体，所述pCM-lux-PahpC载体实现了lux-lacZ-xylE三大报告基因系统的串联；所述pCM-lux-PahpC载体具有BamHI、XhoI、PstI、SpeI的多克隆位点；

(3)将构建好的pCM-lux-PahpC载体测序确认后，转入恶臭假单胞菌Pseudomonasputida KT2440中，所得菌株称之为KT2440OX菌株，即为过氧化氢全细胞生物传感器；

步骤(1)扩增lux报告基因所采用的引物为

lux基因正向扩增引物：

cagaaagcatgccggggatccCTCGAGCTGCAGACTAGTAGGCTTGGAGGATACGTATGAC

lux基因反向扩增引物：

cgtaatcatggtcatggatcTCAACTATCAAACGCTTCGGTTAA

其中小写下划线序列为载体上的同源臂序列，斜体大写字母为通过引物添加的多克隆位点序列；

步骤(2)扩增启动子时采用的引物为：

PahpC启动子的正向扩增引物

ahpC ins cagaaagcatgccggggatccGAGCCCCTCCTTGAATGTCG

PahpC启动子的反向扩增引物

ahpC ina agtctgcagctcgagggatccTCATGGGGTTGGAATCAGTTG。

2.根据权利要求1所述制备方法获得的过氧化氢全细胞生物传感器。

3.如权利要求2所述的过氧化氢全细胞生物传感器的应用，其特征在于，将KT2440OX菌株的菌液加入待测样品中，读取样品的相对发光强度，根据样品的相对发光强度判断样品中是否含有H₂O₂或计算样品中的H₂O₂浓度；

利用已知浓度的H₂O₂样品中加入KT2440OX菌株的菌液后的相对发光强度，建立H₂O₂浓度与相对发光强度之间的关系，再利用样品的相对发光强度计算样品中的H₂O₂浓度；

方法包括以下步骤：

1)、在添加了四环素的LB培养基中将过氧化氢全细胞生物传感器过夜培养，至OD₆₀₀为0.8-1.2；

2)、将标准浓度的H₂O₂溶液及待测样品100μL分别加入96孔板中；

3)、将100μL传感器菌液分别加入待测96孔板上已添加了标准溶液和样品的孔中；

4)、读取样品的相对发光强度；

5)、数据处理，利用已知浓度的H₂O₂构建标准曲线，用于计算未知样品中的H₂O₂浓度；

含有过氧化氢的样品中加入过氧化氢全细胞生物传感器反应两小时后，不同浓度的H₂O₂与相对发光强度之间的关系，进行拟合作图，并得到相关关系公式如下：

y＝-17517*exp(-x/1168)-2222*exp(-x/40)+20450

R²＝0.97331

其中，x为过氧化氢的浓度，单位为μM，y为相对发光强度。