[发明专利]一种B族链球菌快速血清学分型的检测试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种B族链球菌快速血清学分型的检测试剂盒，其特征在于设有盒体和设置于盒体内的检测试纸，所述检测试纸设有底衬、样品垫、标记垫、包被膜和滤纸；所述样品垫由左往右依次连接并设置在底衬上；所述标记垫上含有荧光微球标记的兔抗B族链球菌抗体，包被膜上含有兔抗B族链球菌总抗体及其主要临床致病血清学亚型抗体，包被膜上由左往右依次设置有平行排列的检测T线和质控C线；所述检测T线上可分别包被B族链球菌总抗体及Ia、Ⅱ和Ⅲ三种亚型抗体，质控C线上包被有羊抗兔二抗。

2.如权利要求1所述一种B族链球菌快速血清学分型的检测试剂盒，其特征在于所述包被膜的两端分别与标记垫和滤纸相互交叠连接，所述包被膜上压贴有标记垫。

3.如权利要求1所述一种B族链球菌快速血清学分型的检测试剂盒，其特征在于所述标记垫上压贴有样品垫，所述样品垫为玻璃纤维垫。

4.如权利要求1所述一种B族链球菌快速血清学分型的检测试剂盒，其特征在于所述包被膜为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上同时包被主要致病血清学亚型B族链球菌的单克隆抗体，可实现一次检测鉴别出多种主要致病性病菌，同时通过不同包被方式实现其他用途，单独包被总抗体作为初筛，或单独包被Ia、Ⅱ或Ⅲ中任一种亚型抗体作为单一血清型B族链球菌的分型。

5.如权利要求1所述一种B族链球菌快速血清学分型的检测试剂盒，其特征在于所述盒体上开设有向样品垫添加样品的加样孔和用于观察检测结果的观察窗口。

6.如权利要求1所述一种B族链球菌快速血清分型的检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)荧光颗粒预处理

取出荧光颗粒，超声混匀，再取出N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，在室温平衡10～30min；取100μl荧光颗粒+900μl pH为5.0的2-吗啉乙磺酸溶液，涡旋混匀后离心，弃上清，再加入1ml2-吗啉乙磺酸溶液，超声混匀后离心，弃上清；

2)活化荧光微球

加入600～800μl MES溶液，100～200μl 10mg/mL NHS溶液及10～100μl 10mg/mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液，利用超声混匀，于旋转混合仪上室温活化10～30min，然后离心机离心后弃上清，加入1ml pH为7.0的4-羟乙基哌嗪乙磺酸超声混匀后离心，弃上清后再加1ml HEPES，超声混匀，得到活化的荧光微球；

3)结合B族链球菌抗体

向活化后的荧光微球中加入100～320μg抗体，利用超声混匀，于旋转混合仪上室温反应4～5h，第1次用离心机离心后弃上清，再加1ml封闭液，超声混匀，第2次离心机离心弃上清后加1mL封闭液，超声混匀，置于旋转混合仪上室温封闭30～60min，封闭完成后，第3次离心机离心弃上清后，加入500μl封闭液，超声混匀，得到荧光微球标记兔抗B族链球菌抗体，置于4℃避光保存；

4)标记垫制备

打开冻干机，预冷后将玻纤平铺于玻璃板上，均匀铺上1︰(30～100)的荧光微球工作液，冻干过夜放置于干燥间备用；

5)包被抗体制备

将硝酸纤维素膜NC膜均匀粘贴至PVC底板上，置于常温，50％湿度左右的环境中平衡1～4h待用，从-20℃取出B族链球菌的总抗体和Ia型抗体、Ⅱ型抗体、Ⅲ型抗体及羊抗兔抗体复溶；分别计算以及配置包被抗体，体系如下：GBS总抗体：用10mM磷酸盐缓冲液稀释到终浓度为2～3mg/mL；Ia型抗体：用10mM磷酸盐缓冲液稀释到终浓度为2～3mg/mL；Ⅱ型抗体：用10mM PBS溶液稀释到终浓度为2～3mg/mL；Ⅲ型抗体：用10mM PBS溶液稀释到终浓度为2～3mg/mL，羊抗兔抗体：用10mM PBS溶液稀释到终浓度为0.2～1.0mg/mL；充分混匀后离心10min，上清液转移至另一根管子；用十二烷基硫酸钠和超纯水清洗管路，各20～40个循环，分别在7mm，11mm，15mm，19mm，23mm位置包被Ia型抗体，Ⅱ型抗体，Ⅲ型抗体，总抗体和羊抗兔抗体；设置喷量为1μL/cm，运行仪器，将包被好的NC膜置于湿度<30％，温度为37℃的环境下干燥15h左右；

6)纸条组装

取出干燥后的NC膜，依次组装上吸水纸、标记垫和样品垫，用裁切机切成4mm的宽度，装至塑料卡壳中，利用压壳机压紧卡壳。