[发明专利]hMSC生产试剂盒开发和质量管理标准优化和体系建立

权利要求书

1.一种优化的从胎儿附属物（脐血、脐带、胎盘等）、毛囊、脂肪和牙髓等中分离间充质干细胞（MSC）；人间充质干细胞（hMSC）工业化生产体系和质量管理体系优化和标准建立，MSC扩增培养试剂盒和鉴定试剂盒及应用：

（1）产妇脐带捐献准入标准：

无家族性遗传病及病原微生物感染，知晓并签署知情同意书；

运输过程：脐带采集管完全密封，运输温度为4℃-25℃；运输时间不应超过24h；

传染病检测：母血或脐血TP /HIV/HBV/HCV/HCMV/EBV/HPV/HHV阴性；储运液取样细菌培养无菌、支原体检测阴性；

母血无凝块、溶血及重度乳糜，储存容器无破损；无母血脐带中可留少量脐血；

脐带标准：重量≥15g，形态饱满呈乳白色；

（2）P2种子细胞库控制

培养液澄清，细胞长梭形涡旋状排列，细胞融合度达80%，P2代种子细胞入种子细胞库前取500ul做内毒素检测，10⁶-10⁷细胞做流式检测，上清和细胞悬液留样，留样样本按照编码规格进行编号；

（3）P5工作细胞库控制

种子细胞复苏，传代培养，待培养至P5代细胞长到80-90%融合时，收获细胞，即为工作细胞库，细胞长梭形涡旋状排列，细胞融合度达80%，细胞数量≥1×10⁹，细胞活率≥90%，P5代工作细胞收获时各取1ml做内毒素检测、真菌和细胞内外病毒因子检测，第二次离心后取20ml上清做菌检、 BSA残留量检测、抗生素残留量检测、EGF、bFGF残留量和支原体检测，P5代细胞入工作细胞库待检区，上清和细胞悬液留样各四份，留样样本按照编码规格编号；

（4）冻存装置：完全密封，细胞编号、类型、冻存日期标记完整清晰，保存位置明确；冻存过程：程序降温；

（5） 复苏过程：37℃快速复苏；

（6） MSC细胞制剂出库控制标准：

细胞数量达标，细胞活率≥90%，内毒素检测阴性；取适量细胞用适量生理盐水悬浮，添加人血白蛋白浓度至3%，经细胞筛过滤；

采用生理盐水袋或专用容器灌装，终体积可根据要求适当选择（5～80）ml，细胞制剂进行细胞数量、活率、内毒素检测，细胞制剂留样4份，留样样本按照编码规则编号；

质保部人员负责做好对细胞制剂出库的审核与质量监督，

细胞制剂接收人即为细胞制剂运输人，负责再次确认、接收出库细胞制剂，并放置进保温血箱，保证细胞制剂安全存放（4～25℃），避光保存和运输，直至运达目的地，自生产之时起，有效期为12小时；

（2）hMSC培养试剂盒，包括容器和装入容器中的临床用MSC细胞扩增培养液MSC-、细胞培养添加剂MSC-，本发明提供一种临床用MSC细胞扩增基础培养液MSC- ，PH7.2～7.4，平衡盐Earle’s 盐 、核苷、L-谷氨酰胺2mM、NaHCO3 2200mg/L、D-葡萄糖 1000mg/L、丙酮酸钠 1mM、酚红指示10mg/L、无机盐、氨基酸、维生素、核糖核苷、脱氧核糖核苷等，使用时添加2mM GlutaMAX™-I和10%Prime FBS，本发明不排除可以采用上述培养基之外的培养基实施培养；

本发明提供一种MSC细胞培养添加剂MSC-，其中含有2-50ng/mL bFGF、2-50ng/ml EGF；

优选的[0012]中，3-20ng/mL bFGF、3-20ng/ml EGF；

MSC按照细胞密度8-10×10³/cm²用完全培养液重悬；

所述完全培养液的配制：MSC- 中添加1/1000 MSC-、2mM GlutaMAX™-I和10%Prime FBS；

（3）一种hMSC鉴定试剂盒，所述临床用MSC细胞流式表型和活性鉴定试剂盒包括五组双色抗体组合物，分别是IgG-Percp-cy5/CD105-PE/CD73/CD90、CD44-PE和Annexin-FINKTC/PI，洗涤液50ml一管，固定液50ml一管；每5-10ul可检测一次，共计50套，所述洗涤液是磷酸盐缓冲液；所述固定液是1%多聚甲醛；

（4）本发明还包括将上述hMSC培养试剂，MSC细胞扩增培养液MSC- 、细胞培养添加剂MSC-和鉴定试剂装入专用洁净容器制备成试剂盒。