[发明专利]hMSC生产试剂盒开发和质量管理标准优化和体系建立

说明书

本发明涉及干细胞治疗技术领域，具体涉及一种优化的从胎儿附属物（脐血、脐带、胎盘等）、毛囊、脂肪和牙髓等中分离间充质干细胞（MSC）,人间充质干细胞（hMSC）工业化生产体系和质量管理标准优化和体系建立；MSC扩增培养试剂盒和鉴定试剂盒及应用。根据《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则》（试行）、《细胞制品研究与评价技术指导原则》(征求意见稿)以及2015版《中国药典》通则9203——药品微生物实验室质量管理指导原则所规定的内容，建立原辅料控制、脐带接收控制及间充质干细胞胞制剂控制的质量标准。本发明优化并建立了工艺和质量标准，提高了产量，为临床应用，实现工业化生产创造了条件。

技术领域

本发明涉及干细胞治疗技术领域，具体涉及一种优化的从胎儿附属物（脐血、脐带、胎盘等）、毛囊、脂肪和牙髓等中分离间充质干细胞（MSC）,人间充质干细胞（hMSC）工业化生产体系和质量管理标准优化和体系建立； MSC扩增培养试剂盒和鉴定试剂盒及应用。

背景技术

人间充质干细胞(human MSCs, hMSCs)是一类具有一定的自我复制更新和多向分化潜能的成体干细胞，广泛存在于胎儿和成人各组织中，如骨髓、脂肪、皮肤、牙髓、肌腱，以及新生儿附属组织，如脐带、胎盘、羊膜等组织。除一定程度的分化潜能外，hMSCs还具有独特的免疫调控和组织再生功能，参与调控异常免疫反应、维护免疫平衡，帮助机体形成有利于病损组织细胞修复或再生的微环境，以促进损伤组织细胞的修复或再生。

hMSCs独特的生物学功能决定了其应具有广泛的临床适应症，并使其成为近十年来细胞治疗领域中发展最为广泛、最为迅速的干细胞类型。过去10年来所积累的大量临床前及临床研究数据显示，不同组织来源的hMSCs均具有不同程度，针对不同临床适应症的治疗效果。目前在clinicaltrial.gov登记的各种自体或异体组织来源的hMSCs临床适应症类型或疾病亚型已有上百种，其中常见的临床适应症类型包括骨关节疾病、心血管疾病、器官功能衰竭、神经退行性疾病、移植物抗宿主病、多发性硬化、脊髓损伤、炎性结肠炎、脊髓侧索硬化、系统性红斑狼疮等。

然而，无论是临床前或临床研究阶段，现有的研究结果仍都存在不同程度的问题，而所有问题又都不同程度地汇聚到hMSCs的质量问题上。其中临床前研究所表现的问题是，不同研发者所使用的hMSCs来源、培养体系、制备工艺、质量标准、评价技术等存在很大差异，也存在质量评价内容和评价技术的合理性等问题，很难形成相对统一的质量标准；临床研究阶段细胞质量的稳定性研究欠缺，细胞质量评价和受试者评估体系尚未建立等。

类似于所有治疗性细胞产品，hMSCs代表着人类医药发展史上最为复杂的医药产品，具有传统医药产品难以比拟的多样性、变异性、复杂性和不稳定性等质量特性。为了有效保障包括hMSCs在内的所有治疗性细胞的质量，为其标准化使用建立标准和规范化管理体系，hMSCs具备基本细胞生物学属性、微生物学安全性、生物学安全性及生物学有效性“四大类”质量属性。这“四大类”质量属性，是质量标准、质量体系建立的对象，是临床前研发阶段首要解决的关键问题，也是整个细胞产品研发周期全质量要素的基础。

在临床应用中，MSC细胞培养过程中采用的试剂较多，标准不一致，培养过程中工作量大，培养时间长，工艺繁琐，不稳定，染菌风险大，细胞质量标准难以控制，难在短时间内培养出质量均一的MSC细胞，迫切需要开发简单、格式化的试剂盒，本发明提供一种MSC细胞培养添加剂MSC-Ⅱ，对添加剂的配方进行了优化，使MSC增殖能力提高10-20%，同时优选了血清，使生产成本降低50%，本发明改进了工艺，这对获得大量间充质干细胞，满足临床试验，实现工业化生产具有重要的意义；同时本发明优化了脐带原代组织处理工艺，组织块贴壁率达到95%以上，原代细胞得率提高10倍；优化了传代培养工艺，用预传代细胞的培养上清液终止消化，防止细胞出现损伤性拉丝，使显微镜下视野中细胞拉丝率降低至1%以下，传代细胞扩增倍数由5倍提高至10倍，提高了细胞产量，由于细胞上清液是废液，用来终止消化，降低了原材料消耗和生产成本。

发明内容