[发明专利]一种外源基因定点整合的打靶载体及其应用在审
申请号: | 201910727202.9 | 申请日: | 2019-08-07 |
公开(公告)号: | CN110564764A | 公开(公告)日: | 2019-12-13 |
发明(设计)人: | 李奎;阮进学;韩晓松;熊友才;庄荣志;裴杨莉;杨亚岚;周荣;于辉;张垒霞 | 申请(专利权)人: | 佛山科学技术学院 |
主分类号: | C12N15/85 | 分类号: | C12N15/85;C12N15/90 |
代理公司: | 44205 广州嘉权专利商标事务所有限公司 | 代理人: | 朱继超 |
地址: | 528000 广东*** | 国省代码: | 广东;44 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 打靶载体 同源臂 终止密码子 打靶序列 定点整合 构建 基因功能研究 外源基因序列 多克隆位点 血清蛋白质 制备转基因 种外源基因 肽编码序列 表达载体 低分子量 上游序列 外源基因 下游序列 转基因猪 剪切 表达量 恒定的 内源性 外显子 转外源 细胞 基因 | ||
本公开提供了一种外源基因定点整合的打靶载体,所述打靶载体是由表达载体的多克隆位点反向插入打靶序列而成,打靶序列从左到右依次为左侧同源臂序列、2A剪切肽编码序列、外源基因和右侧同源臂序列,左侧同源臂序列为猪B2M基因终止密码子上游序列,右侧同源臂序列为猪B2M基因终止密码子下游序列,猪B2M基因终止密码子位于猪B2M基因第3外显子上。所述打靶载体所使用的B2M基因能够在机体中产生一种内源性低分子量血清蛋白质,在多种细胞和组织中表达量是恒定的,不受其他因素的影响,所构建的打靶载体可将任意外源基因序列定点整合至猪B2M基因下游,能够高效构建稳转外源基因的细胞系及转基因猪模型,为基因功能研究及制备转基因猪提供有用的工具。
技术领域
本公开属于动物基因工程领域,具体涉及一种外源基因定点整合的打靶载体及其应用。
背景技术
在构建转基因动物及基因获得(gain-of-function)功能研究的过程中,外源基因能否正确且高效稳定的在动物基因组中进行表达,是转基因技术是否成功的关键。外源基因在动物基因组中随机整合会因为基因的位置效应和剂量效应引起表达不稳定或受到表观修饰而沉默表达。而将外源基因定点整合至特定位点则会避免上述情况的发生,可使外源基因在基因组中持续稳定的表达。近年来,随着ZFN、TALEN技术,尤其是CRISPR/cas9技术的出现,为外源基因定点整合提供了新的工具,大大提高了基因定点整合的效率,并且在多个物种中获得了成功。然而,基因定点整合的一个关键因素是位点的选择,一个好的位点应该使得不同来源不同类型的外源基因可以在目标基因组中不同时间不同组织中都能保持高效稳定的表达,且对内源基因在基因组内的表达没有不利的影响。
目前在猪中报道的可用于定点整合外源基因的位点相对较少,且可以借助内源基因启动子直接驱动外源基因的表达更是鲜有报道,因此提供新的安全的友好定点是非常重要和有益的。
发明内容
本公开的目的是提供一种外源基因定点整合的打靶载体及其应用,以获得新的安全的友好的定点。
为实现上述目的,技术方案如下:
一种外源基因定点整合的打靶载体,所述打靶载体是由表达载体的多克隆位点反向插入打靶序列而成,所述打靶序列从左到右依次为左侧同源臂序列、2A剪切肽编码序列、外源基因和右侧同源臂序列,所述的左侧同源臂序列为猪B2M(beta-2-microglobulin,beta-2-微球蛋白)基因终止密码子的上游序列,所述右侧同源臂序列为猪B2M基因终止密码子的下游序列,所述猪B2M基因终止密码子位于猪B2M基因第3外显子上。
左侧同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述2A剪切肽编码序列为编码P2A剪切肽的核苷酸序列,如SEQ ID NO.2所示。
右侧同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
表达载体为真核表达载体或克隆载体,优选的所述真核表达载体为Pcdna3.1(+)。
所述打靶序列插入的位点为HindIII与Kpn1位点之间。
用于靶向猪B2M基因终止密码子的sgRNA序列为SEQ ID NO.4。
所述外源基因为猪生长激素基因、UCP1基因和荧光蛋白基因等。
上述外源基因定点整合的打靶载体在获得定点敲入外源基因的细胞系或转基因猪上的应用。
本公开的有益效果是:提供了一种外源基因定点整合的打靶载体及其应用,所述打靶载体所使用的B2M基因在机体中能够产生一种内源性低分子量血清蛋白质,在多种细胞和组织中表达量是恒定的,不受其他因素的影响,为表达稳定的基因,所以所构建的打靶载体可将任意的外源基因序列定点整合至猪B2M基因下游,能够高效构建稳转外源基因的细胞系及转基因猪模型,可为基因功能研究及制备转基因猪提供有用的工具。
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