[发明专利]鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒鉴别诊断试剂盒

权利要求书

1.一种用于鉴别鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒的特异性引物，包括用于检测鸭3型腺病毒的检测引物DAdV3-1/DAdV3-2，和用于检测鸭新型呼肠孤病毒的检测引物NDRV-7/NDRV-8；所述检测引物DAdV3-1/DAdV3-2的核苷酸序列如下所示：

DAdV3-1：5'-TTCTTCAGGCGCTATGTCTG-3'；

DAdV3-2：5'-ATGGAAGCCTTGTCAAGCC-3'；

所述检测引物NDRV-7/NDRV-8核苷酸序列如下所示：

NDRV-7：5'-ATGTCGCTGTCACGGGTAA-3'；

NDRV-8：5'-TGGTAGGAACCACGCTCAA-3'。

2.权利要求1所述的特异性引物在制备鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒鉴别诊断试剂盒中的应用，在鉴别鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒中的应用。

3.一种鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒鉴别诊断试剂盒，包括权利要求1所述的用于鉴别鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒的特异性引物，以及阳性质粒，还包括PCR反应所必需的试剂；所述阳性质粒为重组质粒T-DAdV3和T-NDRV。

4.根据权利要求3所述的鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒鉴别诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒以100次用量计，包括如下组分：RT-PCR反应液体系4800μL，阳性质粒200μL；所述RT-PCR反应液中含有权利要求1所述的用于鉴别鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒的特异性引物；所述阳性质粒为终浓度均为0.1ng/μL的重组质粒T-DAdV3和T-NDRV的混合物。

5.根据权利要求4所述的鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒鉴别诊断试剂盒，其特征在于：所述RT-PCR反应液体系由括如下组分组成：

6.根据权利要求3或4所述的鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒鉴别诊断试剂盒，其特征在于：所述重组质粒T-DAdV3或T-NDRV，可按如下方法制备得到：提取DAdV3或NDRV病毒核酸，并利用引物DAdV3-1/DAdV3-2、或NDRV-7/NDRV-8进行PCR和RT-PCR扩增目的条带，回收目的条带，与载体pMD18-T相连接，转化至DH5α感受态细胞，并提取质粒，PCR鉴定阳性后送测序；取序列正确的质粒标记为T-DAdV3或T-NDRV，分别作为DAdV3、NDRV的阳性对照。

7.根据权利要求6所述的鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒鉴别诊断试剂盒，其特征在于：所述DAdV3阳性PCR扩增的反应体系(50μL)由如下组分组成：ddH₂O 38.5μL、10×PCR缓冲液5μL、2.5mM dNTP 3μL、5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL、20pmol/μL上下游引物各0.5μL、样品核酸2μL；

或/和：所述DAdV3阳性PCR扩增的反应程序为：95℃5min预变性；94℃变性15sec、55℃退火15sec、72℃延伸30sec，共30个循环；72℃延伸5min；

或/和：所述NDRV阳性RT-PCR扩增的反应体系(50μL)由如下组分组成：DEPC处理水22μL、2×One Step RT-PCR mix 25μL、20pmol/μL上下游引物各0.5μL、样品核酸2μL；

或/和：所述NDRV阳性RT-PCR扩增的反应程序为：50℃反转录30min、94℃变性2min；94℃变性15sec、55℃退火15sec、72℃延伸20sec，共30个循环；72℃延伸5min。

8.权利要求3-7中任一项所述的鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒鉴别诊断试剂盒在鉴别鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒中的应用。