[发明专利]一种检测GP5基因5’端甲基化的试剂盒及其检测方法

说明书

本发明公开了一种检测GP5基因5’端甲基化的试剂盒及其检测方法，包括GP5基因5’端甲基化特异性扩增反应液和侧向流核酸检测试纸。基于PCR方法对GP5基因5’端甲基化进行识别与扩增，对扩增产物进行标记后，结合侧向流技术，对GP5基因5’端甲基化进行检测。本发明的有益效果是，采用简单高效的DNA甲基化处理技术和PCR扩增技术，利用纳米彩色乳胶微球作为核酸检测的可视化信号，代替荧光探针等光学信号，无需复杂的操作和昂贵的仪器，实现比同类技术或产品更好的检测灵敏性和特异性，实现快速、方便、灵敏、经济地检测GP5基因5’端甲基化，适合推广应用和产业化。

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别是一种检测GP5基因5’端甲基化的试剂盒及其检测方法。

背景技术

乳腺癌(BC)是女性中最常见的恶性肿瘤，每年导致超过50万人死亡。目前，随着医学的进步，特别是在I期和II期乳腺癌中，5年生存率相当可观。但由于许多乳腺癌患者相对年轻。乳腺癌的高复发和转移仍然是患者治愈路上的主要障碍。

近年来，很多研究表明，某些基因的DNA甲基化与乳腺癌的发展密切相关。基因组中异常的DNA甲基化可能通过沉默多种肿瘤抑制基因而促成恶性转化。这种表观遗传改变被认为发生在肿瘤发展的早期，可能先于遗传改变。其中，由伦敦大学学院于2018年领导的一项研究发现，乳腺癌样本中名为EFC#93的DNA区域显示异常的DNA甲基化模式。EFC#93区域位于GP5基因N端临近信号肽的部分，即LRRNT区域，该区域异常的甲基化与转移性乳腺癌有关。

该研究显示，GP5基因5’端甲基化和CTC均为阳性的BC患者，其5年内复发率高于70％。因此，该研究认为血清中，GP5基因5’端甲基化异常可以作为转移性乳腺癌患者的检测指标，特异性可高达88％，最多可将诊断时间提前1年。

从血清中检测游离DNA的甲基化异常，要求检测方法具有极高的灵敏度和特异性。目前常见的方法有MSP、Methylight和Heavymethyl。其中MSP是最常见的方法，但容易出现假阳性。而Methylight和Heavymethyl均是基于荧光PCR，需要昂贵的仪器和复杂的操作、分析流程。

发明内容

本发明旨在一定程度上解决上述相关技术中的技术问题之一。因此，本发明的目的在于提出一种检测GP5基因5’端甲基化的试剂盒及其检测方法，可用于体外定性检测转移性乳腺癌患者血清、血浆中GP5基因5’端的甲基化，采用简单高效的DNA甲基化处理技术和PCR扩增技术，利用纳米彩色乳胶微球作为核酸检测的可视化信号，代替荧光探针等光学信号，无需复杂的操作和昂贵的仪器，实现比同类技术或产品更好的检测灵敏性和特异性，实现快速、方便、灵敏、经济地检测GP5基因5’端甲基化，适合推广应用和产业化。

为解决上述问题，本发明采用的技术方案是：

第一方面，本发明提供一种检测GP5基因5’端甲基化的试剂盒，包括人GP5基因5’端甲基化特异性扩增反应液和侧向流核酸检测试纸；所述GP5基因5’端甲基化特异性扩增反应液包括甲基化DNA处理组分、GP5基因5’端甲基化特异性引物组、热稳定性DNA聚合酶、UNG酶和反应缓冲液，所述侧向流核酸检测试纸包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜检测区和吸水垫。

所述甲基化DNA处理组分为亚硫酸盐溶液或甲基化依赖性的限制内切酶；所述亚硫酸盐溶液包括3-5M亚硫酸氢钠、5％-10％乙二醇二甲醚和5-10mM氢醌；所述甲基化依赖性的限制内切酶为MteI、LpnPI、BlsI、GlaI、PcsI、KroI中的一种或几种。