[发明专利]一种携带CXXC4基因的慢病毒载体及其应用

权利要求书

1.一种携带CXXC4基因的慢病毒载体，其特征在于：由pEGFP-N1-CXXC4，psPAX2及pMD2.G三种质粒按质量比为4：3：1混合而成。

2.根据权利要求1所述的携带CXXC4基因的慢病毒载体，其特征在于：pEGFP-N1-CXXC4质粒中CXXC4的核苷酸序列，如SEQ ID NO:1所示。

3.一种如权利要求2所述的慢病毒载体携带的CXXC4基因在细胞内表达的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)用无血清无抗生素的DMEM将细胞分到6孔板中，每个孔2ml培养基，使24h后细胞密度达到60％-70％融合度；

2)取一只洁净无菌离心管，取转染助剂12μl，再加入238μlDMEM溶液吹打混匀，终体积250μl，室温放置5分钟；

3)另取一只洁净无菌离心管，按比例加入质粒DNA：8μg体系，pEGFP-CXXC4-N1、psPAX2及pMD2.G三者的质量比为4：3：1；及适量DMEM溶液，用枪轻轻吹打混匀，终体积为500μl；

4)将步骤2与3中的质粒溶液与转染助剂溶液混合，用枪轻轻吹打混匀，室温孵育20分钟；

5)把1ml质粒溶液与转染助剂溶液的混合液全部加入六孔板的一个孔内，随后轻轻8字摇摆混匀；

6)细胞培养箱内培养24小时后，去除含有质粒DNA与转染助剂的无血清无抗生素DMEM培养液，更换成含10％FBS的DMEM培养液，并从此刻开始算时间；

7)24h-48h后，荧光显微镜下观察，转染成功的细胞表达绿色荧光。

4.一种如权利要求2所述的提高CXXC4基因在细胞中表达比率的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，测定筛选药物G418的IC50浓度：

1)用DMEM将1g/L的G418稀释成1mg/L，800μg/L，500μg/L，400μg/L，200μg/L，100μg/L一共6个浓度梯度；

2)将未转染慢病毒载体的细胞以1×10⁵cells/ml的浓度接种于6孔板，在每孔中加入2ml含G418的DMEM，每孔对应一个浓度；

3)24h后换液成含10％FBS的DMEM培养液，观察细胞生长情况，以第48h时，未转染慢病毒载体的细胞死亡一半的G418浓度，作为IC50浓度；

步骤二，筛选CXXC4基因表达阳性的细胞：

1)将转入CXXC4基因的细胞以1×10⁵cells/ml的浓度接种于6孔板，在每孔中加入2ml具有IC50浓度的含G418的DMEM培养液；

2)24h后弃去悬浮细胞，换液成含10％FBS的DMEM培养液，48h后再次换成具有IC50浓度的含G418的DMEM培养液，此步骤重复几次，直到荧光显微镜下观察发现表达绿色荧光的细胞占总细胞的95％以上。