[发明专利]一种携带CXXC4基因的慢病毒载体及其应用

说明书

本发明涉及一种携带CXXC4基因的慢病毒载体及其应用，包括：携带CXXC4基因的慢病毒载体，由pEGFP‑N1‑CXXC4，psPAX2及pMD2.G三种质粒按质量比为4：3：1混合而成；pEGFP‑N1‑CXXC4质粒中CXXC4的核苷酸序列，如SEQ ID NO:1所示；慢病毒载体携带的CXXC4基因在细胞内表达的方法；提供了提高CXXC4基因在细胞中表达比率的方法：测定筛选药物G418的IC50浓度，筛选CXXC4基因表达阳性的细胞。本发明的有益效果是：通过质粒合理质量配比，可以高效构建过表达CXXC4的慢病毒基因载体；按本方法制作的慢病毒基因载体构建便捷，导入基因到目的细胞的效率高；本发明在制备相关生物靶向制剂中具有巨大临床应用价值。

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及一种携带CXXC4基因的慢病毒载体及其应用。

背景技术

多形性胶质母细胞瘤(GBM)是中枢神经系统(CNS)最常见、最致命的原发性恶性肿瘤。罹患人群的预后均较差，中位生存期为12-16个月，5年生存率仅为5.5％左右。

近年来的研究发现，GBM基因组的异常改变是造成其发生发展的复杂性以及其引起各种恶性行为的根源，深入探索研究异常变化的基因，并采用相应的分子生物学方法进行干预，对于患者病情控制、疾病的治疗、患者最终预后是十分必要的。

人类CXXC4基因定位于4q24，编码一个含CXXC型锌指域的蛋白，该蛋白在果蝇中作为典型无翼/整合信号通路的拮抗剂发挥作用。编码蛋白通过与突触后密度蛋白/果蝇盘大肿瘤抑制因子/闭锁小带相互作用负性调节无翼/整合信号传导，这是一种稳定转录辅激活物β-连环蛋白所需的支架蛋白。此外，该蛋白的CXXC结构域已被证实与非甲基化的CpG二核苷酸结合，定位到启动子和CpG岛，并与2型甲基胞嘧啶10-11易位双加氧酶的催化结构域相互作用，后者是一种修饰DNA甲基化状态的铁和α酮戊二酸依赖的双加氧酶。

研究者发现，在人类中，CXXC4这种基因的低表达异常与恶性肾细胞癌、肠癌、乳腺癌和前列腺癌的发生有关；我们也在本研究的前期阶段发现，CXXC4高表达GBM患者的中位生存期要明显长于低表达患者。我们知道，持久的增殖信号，细胞死亡受阻，浸润和转移等这些肿瘤细胞的特性，是导致肿瘤细胞恶性行为的重要因素，是存在于在恶性肿瘤中普遍现象。前期研究表明，CXXC4基因可以使肿瘤细胞在增殖、侵袭、迁移及成瘤等能力方面发生的改变。CXXC4基因表达可以使细胞增殖速度降低、凋亡增多、侵袭迁移降低、成瘤能力减弱等现象可以被逆转。

因此，将CXXC4基因在肿瘤细胞中过表达，可以发挥肿瘤精准治疗的作用，从而为控制肿瘤细胞生长提供新的手段。慢病毒载体可以将基因导入目标细胞，使基因在目标细胞胞浆中稳定复制转录，从而得到稳定的表达。目前，尚未见携带CXXC4基因的慢病毒载体及使CXXC4基因在目标肿瘤细胞中高效表达的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术不足，提供一种携带CXXC4基因的慢病毒载体及其应用。

携带CXXC4基因的慢病毒载体，由pEGFP-N1-CXXC4，psPAX2及pMD2.G三种质粒按质量比为4：3：1混合而成。

作为优选：pEGFP-N1-CXXC4质粒中CXXC4的核苷酸序列，如SEQ ID NO:1所示。

慢病毒载体携带的CXXC4基因在细胞内表达的方法，包括如下步骤：

1)用无血清无抗生素的DMEM将细胞分到6孔板中，每个孔2ml培养基，使24h后细胞密度达到60％-70％融合度；

2)取一只洁净无菌离心管，取转染助剂12μl，再加入238μl DMEM溶液吹打混匀，终体积250μl，室温放置5分钟；