[发明专利]一种针对发酵乳中以醋化醋杆菌为主的系列杂菌污染的高精度特异性数字PCR检测方法

权利要求书

1.一种针对发酵乳中以醋化醋杆菌为主的系列杂菌污染的高精度特异性数字PCR检测方法，所述系列杂菌包括：沙门氏菌、志贺氏菌、阪崎克罗诺杆菌、醋化醋杆菌，其特征在于：该方法首先对待测杂菌进行死菌去干扰处理，然后对细菌DNA进行低杂质高纯度的提取，研发设计待测菌的特异性引物探针，设定ddPCR反应体系、反应程序及其退火温度，使得检测方法满足特异性、灵敏度和定量化的要求。

2.根据权利要求1所述的一种针对发酵乳中以醋化醋杆菌为主的系列杂菌污染的高精度特异性数字PCR检测方法，其特征在于：

其中，对待测杂菌进行死菌去干扰处理的操作步骤为：

A-1、将传达三次的细菌培养液充分摇匀，吸取100μL增菌液加入到2mL的灭菌透明离心管中；

A-2、将Reagent D从-20℃取出，室温放置融化，取上述增菌液4倍体积的Reagent D溶液加入到A-1中，室温下避光培养5min；

A-3、将离心管放置于低温离心管架中，放在500W的卤素灯相距15cm-20cm的正下方，曝光培养5min后，8000r/min离心5min；

A-4、用移液器小心去除上清液，向离心管中加入100μL无菌去离子水充分混匀，此菌悬液直接用于基因组的提取；

其中，对细菌DNA进行低杂质高纯度提取的操作步骤为：

B-1、准备FoodProof磁珠提取仪，取1mL步骤A处理后的细菌培养液加入至2ml试管中，8000r/min离心5min，弃上清，添加700μL的Lysis Buffer以及80μL的蛋白酶K，65℃振荡水浴30min，12000×g离心力下离心5min，准备好上清用于下面DNA提取；

B-2、准备Tip plate、Binding plate、Washing plate I、Washing plate II、WashingplateⅢ、Elution plate，使用微量移液器或排式微量移液器将每种板子对应的Buffer添加至需要使用的样品孔；

B-3、Binding plate每个样品孔添加250μL的Binding buffer和20μL的磁珠颗粒且两种液体需吹打混匀；Washing plate I每个样品孔需添加600μL的Washing buffer I；Washing plate II每个样品孔需添加800μL的Washing buffer II；Elution plate每个样品孔需添加80μL的Elution buffer；

B-4、分别移取第一步前处理离心完毕500μL裂解液转移至已添加有Binding buffer和磁珠颗粒的Bind plate相应样品孔；

B-5、打开仪器电源开关，进行MPKⅣ提取程序；重复按STARRT按钮，根据屏幕指示分别将Tip plate、Binding plate、Washing plate I、Washing plate II、Washing plate Ⅲ、Elution plate放置到指定位置；所有平板装载完毕后，运行核酸自动提取程序；

B-6、程序运行完毕后，根据仪器屏幕指示开始逐步卸载已经完成核酸提取任务的Tipplate、Binding plate、Washing plate I、Washing plate II、Washing plate Ⅲ、Elutionplate，此时DNA已经溶解于Elution plate可用于后续PCR实验，及时将已经完成核酸提取任务的Binding plate、Washing plate I、Washing plate II、Washing plateⅢ相应样品孔的废液使用微量移液器移除；

B-7、使用微量移液器将Elution plate上提取的DNA分别转移至干净的离心管中定容至80μL，直接用于PCR实验或4-8℃短期保存或-20℃长期保存；

其中，待测菌的特异性引物探针为：

其中，ddPCR反应体系、反应程序及其退火温度设定为：

C、ddPCR反应体系为：2×ddPCR Super Mix 10μL，1.2μL上下游引物10μmol/L，0.4μL探针10μmol/L，4.4μL的模板，灭菌双蒸水补足20μL；

D、ddPCR的反应程序：95℃预变性，10min；94℃变性，1min；退火，45s；进行40个循环，98℃ 10min；

E、沙门氏菌退火温度为54℃；志贺氏菌退火温度为50.7℃；阪崎克罗诺杆菌退火温度为52.6℃；醋化醋杆菌退火温度为54.6℃。