[发明专利]一种针对发酵乳中以醋化醋杆菌为主的系列杂菌污染的高精度特异性数字PCR检测方法

说明书

本发明公开了一种针对发酵乳中以醋化醋杆菌为主的系列杂菌污染的高精度特异性数字PCR检测方法。本发明的方法首先对待测杂菌进行死菌去干扰处理，然后对细菌DNA进行低杂质高纯度的提取，研发设计待测菌的特异性引物探针，设定ddPCR反应体系、反应程序及其退火温度，使得检测方法满足特异性、灵敏度和定量化的要求。本发明构建的方法特异性好，无非特异性扩增，具有良好的灵敏度及定量化优势。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及食品、饮品中有害菌和致病菌的检测检验方法。

背景技术

发酵乳中污染菌和致病菌的质量控制需要精准的检测技术体系作为支撑，发酵乳因其营养丰富的特性能够满足污染菌和致病菌的生长需求，单一的对终产品进行检测容易造成原辅料等生产资源的浪费，从而提高生产成本。因此，不同生产环节的污染菌和致病菌数量的精准检测是进行过程质控的关键。

数字PCR(dPCR)作为第三代PCR的技术代表，由Vogelstein等提出。dPCR是把一个样本的反应体系均匀分配到大量反应单元中，每个反应单元中不包含或包含一个到多个目的核酸序列，独立地进行PCR扩增，检测每个反应单元的荧光信号，最终根据泊松分布以及荧光信号阳性的反应单元数量占所有反应单元的比例，来计算目的核酸序列的拷贝数，dPCR反应中荧光信号的产生过程基本与qPCR相同。目前，该技术已经在稀有突变检测、CNV分析和复杂样本基因表达检测等方面有着广泛的应用。

目前，在科研和实际应用上，均亟需将dPCR技术应用到发酵乳中常见污染菌和致病菌的检测体系构建中，开发出发酵乳中污染菌和致病菌的检测方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种针对发酵乳中以醋化醋杆菌为主的系列杂菌污染的高精度特异性数字PCR检测方法。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。

一种针对发酵乳中以醋化醋杆菌为主的系列杂菌污染的高精度特异性数字PCR检测方法，所述系列杂菌包括：沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、阪崎克罗诺杆菌、醋化醋杆菌，该方法首先对待测杂菌进行死菌去干扰处理，然后对细菌DNA进行低杂质高纯度的提取，研发设计待测菌的特异性引物探针，设定ddPCR反应体系、反应程序及其退火温度，使得检测方法满足特异性、灵敏度和定量化的要求。

作为本发明的一种优选技术方案，对待测杂菌进行死菌去干扰处理的操作步骤为：

A-1、将传达三次的细菌培养液充分摇匀，吸取100μL增菌液加入到2mL的灭菌透明离心管中；

A-2、将Reagent D从-20℃取出，室温放置融化，取上述增菌液4倍体积的ReagentD溶液加入到A-1中，室温下避光培养5min；

A-3、将离心管放置于低温离心管架中，放在500W的卤素灯相距15cm-20cm的正下方，曝光培养5min后，8000r/min离心5min；

A-4、用移液器小心去除上清液，向离心管中加入100μL无菌去离子水充分混匀，此菌悬液直接用于基因组的提取。

作为本发明的一种优选技术方案，对细菌DNA进行低杂质高纯度提取的操作步骤为：

B-1、准备FoodProof磁珠提取仪，取1mL步骤A处理后的细菌培养液加入至2ml试管中，8000r/min离心5min，弃上清，添加700μL的Lysis Buffer以及80μL的蛋白酶K，65℃振荡水浴30min，12000×g离心力下离心5min，准备好上清用于下面DNA提取；

B-2、准备Tip plate、Binding plate、Washing plate I、Washing plate II、Washing plateⅢ、Elution plate，使用微量移液器或排式微量移液器将每种板子对应的Buffer添加至需要使用的样品孔；