[发明专利]快速检测叶黄素循环色素的高效液相色谱法

权利要求书

1.一种快速检测叶黄素循环色素的高效液相色谱法，其特征在于：

从待测叶片中提取叶绿体色素，对叶绿体色素进行色谱分析，通过设置洗脱条件使8种叶绿体色素能高效和快速地分离，最后根据色素标准品的含量和转换因子计算叶绿体色素的含量；

其中，对叶绿体色素进行色谱分析时的色谱条件中包括：先后使用A液和B液进行洗脱，所述A液为：色谱纯甲醇、色谱纯乙腈、Tris-HCl缓冲液按照体积比为11：74：3.5混合得到，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为0.1mol/L、pH值为8.0；所述B液为：色谱纯甲醇和色谱纯乙酸乙酯按照体积比为68：32混合得到。

2.如权利要求1所述的快速检测叶黄素循环色素的高效液相色谱法，其特征在于：从待测叶片中提取叶绿体色素的方法为：所述样品在微暗的室内进行提取，包括以下步骤：

步骤一、将待测叶片按1～6cm²的面积或0.5～1.0g的质量进行定量后，放入研钵，同时加入液氮进行研磨成粉；

步骤二、再加入预冷的色谱纯丙酮进行提取，得到提取液；

步骤三、向提取液中吹入氮气10min，然后在冰浴条件下放置20min，再在4℃、12000g的条件下离心10min，得到第一上清液和沉淀；

步骤四、将得到的沉淀中放入色谱纯丙酮中重新悬浮2次后，在冰浴条件下放置20min，然后在4℃、12000g条件下离心10min，得到第二上清液；

步骤五、将第一上清液和第二上清液合并，并用色谱纯丙酮定容至10～20mL，然后用0.45μm微孔滤膜过滤至EP管中，再往EP管中吹入氮气10min，即得到所述样品。

3.如权利要求1所述的快速检测叶黄素循环色素的高效液相色谱法，其特征在于：所述各色素具体指：新黄质、紫黄质、单环氧玉米黄质、叶黄素、玉米黄质、叶绿素b、叶绿素a和β-胡萝卜素。

4.如权利要求1所述的快速检测叶黄素循环色素的高效液相色谱法，其特征在于：所述色谱条件具体为：

采用4.6×250mm，5μm粒径，非末端封闭的Zorbax ODS层析柱为色谱柱；

A液：色谱纯甲醇、色谱纯乙腈、以及Tris-HCl缓冲液，体积比为11：74：3.5，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为0.1mol/L、pH值为8.0；

B液：色谱纯甲醇和色谱纯乙酸乙酯，体积比为68：32；

流速：1.4mL/min；

上样量：20μL；

色谱柱温度：30℃；

检测波长：440nm。

5.如权利要求1所述的快速检测叶黄素循环色素的高效液相色谱法，其特征在于，上述色谱分析的洗脱程序均为：

先用100％A液洗脱10min；然后在4min内转换到B液，再用100％B液洗脱8min；最后用A液平衡色谱柱8min。

6.如权利要求5所述的快速检测叶黄素循环色素的高效液相色谱法，其特征在于，所述高效液相色谱分析还包括以下步骤：

S1：色谱纯甲醇、色谱纯乙腈、纯水，以11：74：3.5的体积比进行配制，得到C液；

S2：洗脱程序结束后，先用C液以0.5-1mL/min的流速对色谱柱冲洗至少40min；再用色谱纯甲醇以0.5-1mL/min的流速对色谱柱冲洗至少40min。

7.如权利要求5所述的快速检测叶黄素循环色素的高效液相色谱法，其特征在于，所述高效液相色谱分析还包括以下步骤：

S1：将色谱纯甲醇、色谱纯乙腈、以及纯水以11：74：3.5的体积比进行配制C液；

S2、洗脱程序结束后，先用C液以0.5-1mL/min的流速对色谱柱冲洗至少40min；再用色谱纯甲醇以0.1-0.2mL/min的流速对色谱柱进行过夜冲洗。

8.如权利要求6或7所述的快速检测叶黄素循环色素的高效液相色谱法，其特征在于，所述C液可用含5％色谱纯甲醇的纯水代替，且所述纯水在使用前用0.22μm微孔滤膜进行过滤。

9.如权利要求1所述的快速检测叶黄素循环色素的高效液相色谱法，其特征在于，所述色素标准品的色谱峰图和转换因子的获得方法为：

将叶黄素用体积分数为100％的色谱纯乙醇溶解，叶绿素a和叶绿素b用体积分数为80％的色谱纯丙酮溶解，β-胡萝卜素用体积分数为100％的色谱纯正己烷溶解，配置得到各个色素的标准品溶液；

标准品的色谱洗脱流程：先用100％A液洗脱10min；然后在4min内转换到B液，再用100％B液洗脱8min；最后用A液平衡色谱柱8min；流速为1.4mL/min，色谱柱温度为30℃，标准品上样量20μL，在440nm处进行检测，得到色素标准品的色谱峰图；

计算转化因子：首先通过分光光度计测得的吸光值和百分消光系数计算得到色素标准品溶液的浓度，然后再乘以上样量得到用于色谱分析的色素标准品的含量，该色素含量与其色谱峰面积的比值即为转换因子；

其中，新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素b、叶绿素a、以及β-胡萝卜素标准品采用的百分消光系数分别为：2243、2500、2550、518、840、2500g/100mL；

转换因子的计算公式如下：

色素含量＝上样量×色素标准品溶液的浓度；

转换因子＝色素含量/对应色素标准品溶液的色谱峰面积；

其中，单环氧玉米黄质和玉米黄质的转换因子采用叶黄素计算所得的转换因子。