[发明专利]快速检测叶黄素循环色素的高效液相色谱法

说明书

本发明公开了一种快速检测叶黄素循环色素的高效液相色谱法。首先从待测叶片中提取叶绿体色素；然后对叶绿体色素进行色谱分析，通过设置洗脱条件使8种叶绿体色素能高效和快速地分离；最后根据色素标准品的含量和转换因子计算叶绿体色素的含量。以本发明公开的方法对叶黄素循环组分进行检测，不仅能够尽量完全地提取并分离叶绿体色素尤其是叶黄素循环组分的色素，同时能减少用高效液相色谱分析色素的耗时，将常规的一个样品的分析耗时从40min左右缩短至30min左右，并能分离出明显的叶黄质峰。

技术领域

本发明属于色谱检测技术领域，具体涉及一种快速检测叶黄素循环色素的高效液相色谱法。

背景技术

叶黄素循环组分色素多存在于高等植物和绿藻中，它是指紫黄质(Violaxanthin，V)、花药黄质(Antheraxanthin，A)、玉米黄质(Zeaxanthin，Z)在光、暗条件下的相互转化过程。强光下，紫黄质在脱环氧化酶的作用下进行两步脱环氧化作用经花药黄质转化为玉米黄质，反应需要还原型的抗坏血酸和较高的类囊体膜pH梯度；在暗中，有氧气、NADPH和较低的类囊体膜pH梯度时，反应在环氧化酶的作用下发生逆转，玉米黄质和花药黄质重新被环化生成紫黄质。其中脱环氧化状态(de-epoxidation state，DEPS＝(A+Z)/(V+A+Z))的增加通常意味着耗散过剩光能能力的增强，在实践中经常需要计算DEPS以衡量植物叶片耗散过剩光能的能力。

除了3种叶黄素循环组分色素之外，还有另外的2种叶黄素—新黄质(Neoxanthin，N)和叶黄素(Lutein，L)。这5种叶黄素的测定常用高效液相色谱法(high performanceliquid chromatography，HPLC)，其中Thayer和Bjǒkman的方法(Thayer SS,BjǒkmanO.1990.Leaf xanthophyll content and composition in sun and shade determinedby HPLC.Photosynthesis Research,23：331-343)仍然是目前大多数人采用的测定方法。该测定方法不仅能分离出这5种叶黄素，还能同时分离出叶绿素a(Chlorophyll a，Chl a)、叶绿素b(Chlorophyll b，Chl b)和β-胡萝卜素(β-carotene)。但是，这种方法在HPLC分离过程中很难将Z峰从L峰分离，而且一个完整的HPLC分析流程耗时长，大约至少需要40min。鉴于HPLC的成本高，耗时长将会增加试剂和仪器的耗费以及时间和人力成本。

因此，亟需一种可以缩短HPLC分析时间，并能将Z峰较好的分离的检测叶黄素循环组分色素的高效液相色谱法。

发明内容

本发明的目的是解决至少上述的缺陷，并提供以后将说明的优点。

本发明的另一个目的是，在检测叶绿体色素中用于叶黄素循环的色素的同时，可以同时检测得到其他叶绿体色素。

本发明的再一个目的是，通过计算叶黄素循环色素中各个色素的含量和对样品进行脱环氧化状态分析，从而衡量植物叶片耗散过剩光能的能力。

为了实现本发明的这些目的和其他优点，现提供一种快速检测叶黄素循环色素的高效液相色谱法。首先从待测叶片中分离提取叶绿体色素；然后对叶绿体色素进行色谱分析，通过设置洗脱条件使8种叶绿体色素能高效和快速地分离；最后根据色素标准品的含量和转换因子计算叶绿体色素的含量。其中，对叶绿体色素进行色谱分析时的色谱条件中包括：先后使用A液和B液进行洗脱，所述A液为：色谱纯甲醇、色谱纯乙腈、Tris-HCl缓冲液按照体积比为11：74：3.5混合得到，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为0.1mol/L、pH值为8.0，A液用以洗脱叶黄素循环，提高叶黄素循环组分色素与其他色素的分离效果；所述B液为：色谱纯甲醇和色谱纯乙酸乙酯按照体积比为68：32混合得到，B液用以洗脱叶绿素和类胡萝卜素，提高叶绿素和类胡萝卜素与其他色素的分离效果。