[发明专利]一种幽门螺杆菌左氧氟沙星耐药检测方法

权利要求书

1.一种幽门螺杆菌左氧氟沙星耐药检测方法，其特征在于，对左氧氟沙星耐药基因喹诺酮结合位点GyrA进行荧光定量PCR检测，通过检测反应体系中溶解过程释放的荧光信号曲线，根据杂交峰所显示的Tm值区分出敏感型和耐药型。

2.根据权利要求1所述的一种幽门螺杆菌左氧氟沙星耐药检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

第一步，在喹诺酮结合位点GyrA基因的突变位点上下游，通过比对序列选择保守区域设计引物；

第二步，根据GyrA基因的已知耐药突变位点，设计探针；选择的探针覆盖突变位点，使用软件预测各种突变的溶解峰温度，使得两种敏感型的温度明显高于各种突变型的温度，探针修饰的荧光和猝灭基团分别为FAM和BHQ1；

第三步，提取待测样本中的DNA，使用第一步中的引物、第二步中的探针，与其它RT-PCR反应液混合，进行RT-PCR检测；

第四步，根据检测反应结束后形成的溶解曲线杂交峰的位置，即Tm值作为判断标准：高于54℃的为敏感型，低于54℃的为耐药型，54℃前后均出现溶解峰的为混合型。

3.根据权利要求2所述的一种幽门螺杆菌左氧氟沙星耐药检测方法，其特征在于，第一步中，所述的引物分别为：

正向引物F：5’-ATTCCATGAGCGTGATCATAGG-3’；

反向引物R：5’-GTTATCGCCATCAATAGAGCCAAA-3’。

4.根据权利要求1所述的一种幽门螺杆菌左氧氟沙星耐药检测方法，其特征在于，第二步中，所述的探针选择：

探针1：5’-CGATAATGCGGTTTATGATG-3’；或，

探针2：5’-CGATAATGCGGTTTATGATGC-3’。

5.根据权利要求4所述的一种幽门螺杆菌左氧氟沙星耐药检测方法，其特征在于，第二步中，所述的探针选择：探针1：5’-CGATAATGCGGTTTATGATG-3’。

6.根据权利要求1所述的一种幽门螺杆菌左氧氟沙星耐药检测方法，其特征在于，第三步中，RT-PCR反应体系为：

1*buffer，1ul；

25mM MgSO₄，1.2ul；

2.5mM dNTPs，0.8ul；

10uM正向引物F，0.05ul；

10uM反向引物R，0.5ul；

10uM探针P，0.1ul；

TaqDNA聚合酶，0.05ul；

样品DNA，0.4ul；

去离子水，5.9ul；共计10ul。

7.根据权利要求1所述的一种幽门螺杆菌左氧氟沙星耐药检测方法，其特征在于，第三步中，RT-PCR反应条件为：

95℃预变性5min；45个循环中，95摄氏度变性20s，57℃退火30s，72℃延伸20s；72℃彻底延伸5min；95℃变性2min，40℃探针退火杂交3min；溶解曲线从40℃-80℃，每升温1℃记录10次。

8.根据权利要求1所述的一种幽门螺杆菌左氧氟沙星耐药检测方法，其特征在于，第二步设计探针时，已知导致左氧氟沙星的耐药突变类型有：A260T、A260C、C261G、C261A、C263T、G271A、G271T、A272G、A272C，不导致耐药的同义突变为C261T。

9.一种幽门螺杆菌左氧氟沙星耐药检测试剂盒，其特征在于，包含RT-PCR反应液、正向引物F、反向引物R与探针，

其中，

正向引物F：5’-ATTCCATGAGCGTGATCATAGG-3’；

反向引物R：5’-GTTATCGCCATCAATAGAGCCAAA-3’；

探针选择：

探针1：5’-CGATAATGCGGTTTATGATG-3’；或，

探针2：5’-CGATAATGCGGTTTATGATGC-3’。