[发明专利]一种幽门螺杆菌左氧氟沙星耐药检测方法

说明书

本发明涉及一种幽门螺杆菌左氧氟沙星耐药检测方法，属于生物学检测技术领域。对左氧氟沙星耐药基因喹诺酮结合位点GyrA进行荧光定量PCR检测，通过检测反应体系中溶解过程释放的荧光信号曲线，根据杂交峰所显示的Tm值区分出敏感型和耐药型。本发明还提供了幽门螺杆菌左氧氟沙星耐药耐药检测试剂盒。与现有技术相比，本发明通过检测反应体系中溶解过程释放的荧光信号曲线，根据杂交峰所显示的Tm值区分出敏感型和耐药型。本发明灵敏度和特异性高、操作简便、检测速度快，检测结果差异显著易于分型。

技术领域

本发明属于生物学检测技术领域，尤其是涉及一种幽门螺杆菌左氧氟沙星耐药检测方法。

背景技术

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)感染和慢性胃炎、胃溃疡的疾病发生密切相关，世界卫生组织将幽门螺杆菌定为胃癌的I类致癌原。全球约一半的人都感染幽门螺杆菌，但是仅有部分人发展为胃溃疡，可能和幽门螺杆菌的毒力因子基因的多态性有关。目前对于幽门螺杆菌的治疗以抗生素为主，比如克拉霉素、左氧氟沙星、阿莫西林、四环素等，但是幽门螺杆菌对抗生素的耐药性逐年增加，临床上急需一种快速、便捷、准确的耐药检测方法来指导用药。

目前幽门螺杆菌临床检测的方法主要是碳14呼气法和胃黏膜取样培养法。传统的药敏实验检测抗生素耐药需要消耗大量时间来培养胃黏膜分离出的幽门螺杆菌，实验周期往往在2周以上，不能满足快速检测的需求。而且对于多种幽门螺杆菌基因型混合感染的人群来说，分离培养往往无法分辨出比例较小的基因型。

相比于传统检测方法，幽门螺杆菌的分子检测方法更为方便、快捷，其中最有效的方法之一是实时荧光定量PCR(Real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)。在PCR反应扩增出目的片段后，通过特定的带荧光基团和淬灭基团的探针和靶序列的结合，荧光基团和猝灭基团在空间上会分离开足够的距离，从而可以产生被检测到的荧光信号。因为不同的DNA片段和探针碱基之间的结合能力不同，当目的片段出现突变位点时荧光信号会发生变化，从而将突变型区分开来。

在临床最常用的抗生素中，克拉霉素的耐药检测已有相关文献和专利，但是左氧氟沙星因为耐药突变较多以及存在同义突变，使得分子检测较为困难，往往需要设计很多条探针才能检测部分基因型。目前仅有一种商业上可用的分子检测方法，使用4条探针检测，且是根据欧洲的幽门螺杆菌菌株设计，因为和世界上其它地区导致耐药性的突变模式不同，不适用于其它国家。

发明内容

本发明的目的就是为了解决上述背景技术中提出的问题而提供一种幽门螺杆菌左氧氟沙星耐药检测方法。

具体而言，本发明提供一种左氧氟沙星耐药基因喹诺酮结合位点GyrA的荧光定量PCR检测方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种幽门螺杆菌左氧氟沙星耐药检测方法，对左氧氟沙星耐药基因喹诺酮结合位点GyrA进行荧光定量PCR检测，通过检测反应体系中溶解过程释放的荧光信号曲线，根据杂交峰所显示的Tm值区分出敏感型和耐药型。

所述幽门螺杆菌左氧氟沙星耐药检测方法，具体可以包括以下步骤：

第一步，在喹诺酮结合位点GyrA基因的突变位点上下游，通过比对序列选择保守区域设计引物；

第二步，根据GyrA基因的已知耐药突变位点，设计探针；选择合适长度的探针覆盖突变位点，使用软件预测各种突变的溶解峰温度，使得两种敏感型的温度明显高于各种突变型的温度，探针修饰的荧光和猝灭基团分别为FAM和BHQ1；

第三步，提取待测样本中的DNA，使用第一步中的引物、第二步中的探针，与其它RT-PCR反应液混合，进行RT-PCR检测；