[发明专利]人体液中抗GABABR自身抗体的检测材料、制备方法及应用

权利要求书

1.一种人体液中抗GABABR自身抗体检测材料，其特征在于，包括样品检测材料和样品封闭材料，

所述的样品检测材料通过以下制备方法制备获得：

步骤1，获取GABABR的CDS序列作为目的基因，将带有酶切位点的目的基因插入17T2A质粒载体中，得到重组质粒载体17T2A-GABABR；

其中，17T2A质粒载体包括含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列、原核复制子pUC Ori序列、病毒复制子 SV4 0O ri序列、RSV启动子、慢病毒5’LTR、慢病毒3’LTR、Gag顺式元件、RRE顺式元件、env顺式元件、cPPT顺式元件、eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件、CMV启动子、MCS多克隆位点以及T2A元件；

具体包括以下步骤：

步骤1.1：通过人工合成或者PCR方法获得GABABR的CDS序列作为目的基因，在目的基因两端加设SalI/NotI的酶切位点；

步骤1.2：将带有酶切位点的目的基因插入17T2A质粒载体中，插入位点为SalI/NotI，得到重组质粒，将该重组质粒命名为17T2A-GABABR；

步骤1.3：对重组质粒17T2A-GABABR进行测序，将测序正确的带有目的基因的菌种扩大培养后进行质粒提取，得到重组质粒载体17T2A-GABABR；

步骤2，将重组质粒载体17T2A-GABABR转染入293T细胞中，得到17T2A-GABABR-293T细胞；

步骤3，裂解17T2A-GABABR-293T细胞，去除17T2A-GABABR-293T细胞的核蛋白、DNA和胞浆蛋白，再加入复合提取液，4℃静置15~30min后在35~40℃水浴，直至出现分层；具体包括：

弃细胞培养液，用0.85% NaCl清洗细胞1~2次，加入1ml裂解液，所述裂解液由0.85%NaCl、10mM Tris-HCl、1mM EDTA、1×PI组成；

用细胞刮板刮下GABABR细胞，收集细胞至2mL EP管中，针头吹打10次，500g，4℃，3min，收集上清至新的2mL EP管中；

上清中加入复合提取液，4℃静置15~30min后在37℃水浴，直至出现分层；

所述复合提取液为Triton X100、CHAPS、N-甲基葡糖胺按照体积比为1:1:1的比例混合或洋地黄皂苷、Triton X100、NP40、CHAPS按照体积比1:1~2：1~2：1的比例混合；

步骤4，取分层后沉淀，在冰水环境中静置，向沉淀中加入10%PEG的无水乙醇混匀；4℃静置3min，去除上清液，得到沉淀，在沉淀中加入体积重悬液，使其溶解，旋涡混匀后加入10%的甘油，-20℃保存，备用；

所述体积重悬液由10mM Tris-HCl、0.05% NP40和2×PI混合而成；

取0.8μL稀释至合适浓度的上述膜蛋白-细胞膜复合物，使用移液枪以圆形印记将其点在载体膜上，于37℃烘箱中烘烤10 min，得到人体液中抗GABABR自身抗体的检测材料，于4℃密封保存；

所述的样品封闭材料的使用过程为：

将待检测样品和样品封闭材料混合后孵育，孵育后加入到样品检测材料中再次孵育，洗涤，加入AP标记羊抗人IgG二抗孵育后进行底物显色。

2.如权利要求1所述的人体液中抗GABABR自身抗体检测材料，其特征在于，所述的步骤2中使用PEI转染方法、lipofectamin2000、lipofectamin3000、lipA或电转法将17T2A-GABABR转染入293T细胞中，其中，电转条件为1500V~2000V、25μF、200Ω。

3.如权利要求1所述的人体液中抗GABABR自身抗体检测材料，其特征在于，所述的载体膜为硝酸纤维素膜、PVDF膜、尼龙膜、具有蛋白吸附能力的玻片、塑料材质的细胞培养皿或培养板。