[发明专利]Illumina二代测序平台文库构建引入分子标签的方法、接头序列及应用

说明书

本申请提供了一种适用于Illumina二代测序平台的文库构建中引入分子标签方法、接头序列及设计方法、使用所述接头序列构建文库的方法以及含有接头序列的试剂盒。所述接头序列包括：5’‑P‑E‑F‑Q‑3’，其中，P为测序平台配对序列、E为相同碱基构成的随机碱基序列、F为给定碱基序列、Q为Tn5转座酶末端识别序列。本发明所提供的接头序列以及构建文库的方法，可以对低至50pg的DNA样本成功建库，适用于制备DNA建库试剂盒、针对疾病的诊断试剂盒的应用。

技术领域

本发明涉及一种高通量测序文库构建方法，尤其涉及一种适用于Illumina二代测序平台的文库、尤其是文库构建中引入分子标签的方法、接头序列、接头序列设计方法、以及应用。

背景技术

二代测序又称作NGS测序或高通量测序，顾名思义，高通量测序由于其测序反应通量高，一次测序反应我们可以得到1Gb～3Tb的测序数据，人类基因组包括其所编码的2万余个基因序列可以一次性获得。高通量测序准确性也非常高，对于单碱基准确度超过99.9％。高通量测序平台已经实现了从科学研究到临床应用突破，广泛用于产前检测、单基因疾病筛查或诊断、癌症个体化治疗、药物基因组学检测等方面，也是目前应用最为广泛的核酸测序方法。

美国Illumina公司的台式测序系统MiSeqDx与囊性纤维化(一种单基因遗传病)诊断产品在美国获得食品药品监督管理局(FDA)批准，目前Illumina公司的高通量测序仪是市场上应用型最为广泛的二代测序平台。Illumina二代测序平台的工作原理是基于可逆终止的、荧光标记dNTP来边合成边测序。其中，芯片内通道表面有两种接头序列，分别与DNA文库的两端序列互补。构建DNA文库是测序的第一步，标准的文库构建的流程包括了以下几个步骤：核酸的片段化、末端补平、接头连接、目的片段富集和PCR扩增。传统的建库方法过程繁琐、耗时较长，PCR扩增过程中会随机产生大量的拷贝重复，在计算基因变异位点的突变频率时，由于序列重复比对容易造成较大误差，而且对建库的DNA起始质量要求较高(一般要求在50ng以上)。

Tn5酶是最初在大肠杆菌中发现的一种转座子酶，可以将一段DNA序列随机插入到目的DNA序列之中。将两种不同的DNA接头序列组装到Tn5转座酶的复合体中，可对目标DNA进行打断，在打断的同时，Tn5转座酶会将这两种不同的DNA接头序列分别连接在打断的DNA分子的两端。

专利CN103938277B公开了一种测序文库的构建方法，采用的接头序列包括：

接头序列1：

5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGCCTCCCTCGCGCCATCAGAGATGTGTATAAGAGACAG-3’

接头序列2：

5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNCGTGATCGGTCTGCCTTGCCAGCCCGCTCAGAGATGTGTATAAGAGACAG-3’。

其中，NNNNNNNN为8个碱基组成的随机碱基序列，CGTGAT为给定的barcode碱基序列。

发明内容

不同于上述专利中描述的接头序列设计方法，本申请提供了一种新的适用于Illumina二代测序平台的在文库构建中引入分子标签的方法、接头序列、接头序列设计方法、以及应用。

本申请第一个方面是提供一种适用于Illumina二代测序平台的文库构建的接头序列，包括：5’-P-E-F-Q-3’，其中，P为测序平台配对序列、E为随机碱基序列、F为给定碱基序列、Q为Tn5转座酶末端识别序列。

在一种优选实施例中，所述E为5-10个碱基组成的随机碱基序列，更优选为5-8个碱基组成的随机碱基序列，更优选为5-6个碱基组成的随机碱基序列。