[发明专利]一种制备油松针叶原生质体的方法

说明书

本发明公开了一种制备油松针叶原生质体的方法。本发明首先公开了用于制备油松针叶原生质体的组合物，包括纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶；所述组合物中，纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶的质量比为25∶4∶10。本发明进一步公开了包含上述组合物的酶解液和成套试剂及油松针叶原生质体的制备方法。本发明以油松幼嫩针叶作为材料，通过调节酶解体系和洗涤体系，建立油松原生质体制备体系。该体系制备得到的原生质体数量及活性都较好，为后期油松功能基因的亚细胞定位、蛋白质互作、下游靶基因筛选、单细胞测序、原生质体悬浮培养等研究提供了技术保障。

技术领域

本发明涉及植物细胞生物技术领域，具体涉及一种制备油松针叶原生质体的方法。

背景技术

植物原生质体是去掉细胞壁由质膜包被的仍然保持生活力的细胞团，与完整的植物细胞相比，植物原生质体较为脆弱，但其一样含有完整遗传物质，具有全能性，具有再生新植株的潜能。原生质体可以高效摄取微生物，细胞器和核酸等大分子物质，还可以与其不亲和植株的原生质体相互融合进而分化产生新植株。植物原生质体广泛用于细胞壁再生，细胞分化与分裂，胚胎形成，细胞器摄入，病毒侵染，生物与非生物胁迫，信号转导，细胞膜通透性及离子转运，蛋白亚细胞定位，基因功能验证等研究，是一种重要的基础理论研究的多用途细胞体系。

植物细胞壁的主要成分为纤维素，半纤维素和果胶。常用的原生质体制备方法为酶解法。酶解法制备原生质体，在被子植物上应用较多，在裸子植物上应用较少，目前，已经有多种被子植物实现了原生质体的分离条件的优化，如苹果(潘增光.苹果原生质体培养再生及融合研究[D].华中农业大学，1998.)，橡胶树((王凉洁.橡胶树叶肉细胞原生质体的制备及瞬时表达系统对植物免疫反应的检测[D].海南大学，2014.)，桑树(羿德磊，王海朋，崔为正，等.桑树原生质体分离条件的优化试验[J].蚕业科学，2012，38(02)：204-209.)等，此外，国内外已经开发出成熟的拟南芥原生质体制备体系(Yoo S D，Cho Y H，SheenJ.Arabidopsis mesophyll protoplasts：a versatile cell system for transientgene expression analysis[J].Nat Protoc，2007，2(7)：1565-1572.)。在针叶树中，国外对于火炬松(Pinustaeda L.)等研究基础较好的树种开发了原生质体制备体系(Wu F H，Shen S C，Lee LY，et al.Tape-Arabidopsis Sandwich-a simpler Arabidopsisprotoplast isolation method[J].Plant Methods，2009，5：16.；GOMEZ-MALDONADO J，CRESPILLO R，AVILA C，et al.Efficient Preparation of Maritime Pine(Pinuspinaster)Protoplasts Suitable for Transgene[J].Plant Molecular BiologyReporter，2001.；唐巍，欧阳藩，郭仲琛.影响火炬松胚性悬浮细胞原生质体的胚胎发生的因素(英文)[J].DevelopmentalReproductive Biology，1997(02)：56-63.)，但这些体系分离效率低且分离后的原生质体状态差，难以进行后续实验。

油松是中国的特有乡土树种，主要分布于中国华北、西北及东北的14个省市自治区，生态适生区达300kM²。油松具有抗干旱、耐瘠薄、适生范围广、生长速度稳定等特点，是重要用材、生态和景观树种，具有重要的经济、生态和社会价值。作为针叶树的一种，油松是研究裸子植物的重要的材料。但是由于成年油松体细胞具有很低的再生能力，使得对于油松的生物学研究一直处于瓶颈期。

因此，高效制备油松原生质体不仅为油松的功能基因亚细胞定位、蛋白质互作、下游靶基因筛选、单细胞测序、原生质体悬浮培养等研究提供了技术保障，也为其他物种原生质体分离的研究提供了参考。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为如何高效的制备油松针叶的原生质体。