[发明专利]简易高效的鲟鱼白细胞分离方法

权利要求书

1.一种简易高效的鲟鱼白细胞分离方法，其特征在于，包括如下工艺步骤：

1)将鲟鱼的离体血液与抗凝剂按照1～2:1～3的体积比进行混合，在4℃环境下静置1-1.5小时，然后离心并收集上清，获得血液上清液；

2)将Percoll原液与NaCl溶液按照9:1的体积比混合配制成的Percoll液，再用NaCl溶液将Percoll液稀释成所需体积比重的分离液；其中，NaCl溶液的质量浓度为0.85％；

3)取无菌离心管，用胎牛血清对离心管进行润洗后，加入分离液，再沿管壁缓慢加入步骤1)中的血液上清液，使用水平转子400g-500g离心25-30min，管中液体分为三层，中间层为鲟鱼白细胞。

2.根据权利要求1所述的简易高效的鲟鱼白细胞分离方法，其特征在于：所述的抗凝剂的组成包括按质量份数计算，包括60-65％L-15培养基，35-40％双蒸水，100-150 U/ml青霉素和100-150 U/ml链霉素，并且均匀混合后加入15-20IU/mL Heparin。

3.根据权利要求1所述的简易高效的鲟鱼白细胞分离方法，其特征在于：步骤1)中所述的离心条件为水平转子4℃，100g-200g离心10-15min。

4.根据权利要求1所述的简易高效的鲟鱼白细胞分离方法，其特征在于：步骤2)中所述的所需体积比重的分离液的比重为50％-80％。

5.根据权利要求1所述的简易高效的鲟鱼白细胞分离方法，其特征在于：步骤3)中血液上清液与分离液的体积比例为1-1.5：1。

6.根据权利要求1所述的简易高效的鲟鱼白细胞分离方法，其特征在于：步骤3)中所述的沿管壁缓慢加入步骤1)中的血液上清液，保证试管中血清样品与分离液分界面清晰，防止血液上清液与分离液混合。

7.根据权利要求1所述的简易高效的鲟鱼白细胞分离方法，其特征在于：对步骤3)中分离出来的鲟鱼白细胞进行纯化处理，具体方法为：用注射器或者移液枪将分离出来的中间层进行收集并转入新的无菌离心管中，用L-15培养基重悬细胞，然后4℃，400g-600g离心10-15min，倒掉上清液，试管底部白色沉淀即为白细胞；重复洗涤纯化2-3次。