[发明专利]简易高效的鲟鱼白细胞分离方法

说明书

本发明公开了一种简易高效的鲟鱼白细胞分离方法。本发明的操作简单，能一次性分离出大量的白细胞，并且分离出来白细胞的纯度高；克服了现有技术中，鱼类白细胞的分离方法步骤复杂，操作难度高，且单次分离效果不理想，且需要多次富集的问题。因此，本发明能弥补鲟鱼白细胞分离相关研究的空白，为鲟鱼在免疫机能上的研究提供理论支撑。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种简易高效的鲟鱼白细胞分离方法

背景技术

鲟鱼(Acipenser sturio Linnaeus)隶属于硬骨鱼纲(Osteichthyes)辐鳍亚纲(Actinopterygii)软骨硬鳞总目(Chondrostei)鲟形目(Acipenseriformes)，是现存最古老的脊椎动物之一。其肉质嫩滑，味道鲜美，营养丰富，容易饲养，养殖经济效益高，是受广大消费者青睐的名贵水产品。而随着天然资源数量与市场需求差距日渐增大，鲟鱼养殖业得到迅速发展。

白细胞是机体体液免疫和细胞免疫的重要组成部分，利用白细胞作为试验材料已经广泛应用到生理学、肿瘤学、内分泌学、免疫学等方面。而利用原代细胞较使用细胞系进行试验的技术难度低，试验条件简单，同时也更接近机体本身生理条件，使试验结果更具说服力。

目前已有一些关于鱼类白细胞的分离的文献和专利，但未见鲟鱼白细胞分离相关方法的研究，同时现有一些鱼类白细胞的分离方法步骤复杂，操作难度高，且单次分离效果不理想，且需要多次富集。因此，本专利主要介绍一种关于鲟鱼白细胞简单、高效的分离方法，为鲟鱼白细胞分离及机体免疫相关研究提供参考依据。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种简易高效的鲟鱼白细胞分离方法，它分离方式简单，且分离效率高、分离效果好。

本发明是这样实现的：简易高效的鲟鱼白细胞分离方法，包括如下工艺步骤：

1)将鲟鱼的离体血液与抗凝剂按照1～2:1～3的体积比进行混合，在4℃环境下静置1-1.5小时，然后离心并收集上清，获得血液上清液；

2)将Percoll原液与NaCl溶液按照9:1的体积比混合配制成的Percoll液，再用NaCl溶液将Percoll液稀释成所需比重的分离液；其中，NaCl溶液的质量浓度为0.85％；

3)取无菌离心管，用胎牛血清对离心管进行润洗后，加入的连续梯度分离液，再沿管壁缓慢加入步骤1)中的血液上清液，使用水平转子400g-500g离心25-30min，管中液体分为三层，中间层为鲟鱼白细胞。

所述的抗凝剂的组成包括按质量份数计算，包括60-65％L-15培养基，35-40％双蒸水，100-150U/ml青霉素和100-150U/ml链霉素，并且均匀混合后加入15-20IU/mLHeparin。

步骤1)中所述的离心条件为水平转子4℃，100g-200g离心10-15min。

步骤2)中所述的所需体积比重的分离液的比重为50％-80％。

步骤3)中血液上清液与分离液的体积比例为1-1.5：1。

步骤3)中所述的沿管壁缓慢加入步骤1)中的血液上清液，保证试管中血清样品与分离液分界面清晰，防止血液上清液与分离液混合。

对步骤3)中分离出来的鲟鱼白细胞进行纯化处理，具体方法为：用注射器或者移液枪将分离出来的中间层进行收集并转入新的无菌离心管中，用L-15培养基重悬细胞，然后4℃，400g-600g离心10-15min，倒掉上清液，试管底部白色沉淀即为白细胞；重复洗涤纯化2-3次。