[发明专利]一种分离纯化重组LEA蛋白的方法及试剂盒

权利要求书

1.一种分离纯化重组LEA蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：

a)、将重组LEA质粒转化到Rosseta表达菌株，IPTG诱导目标蛋白表达；

b)、经细胞破碎处理所述的菌株样品并获得包含所述LEA蛋白的裂解液；

c)、向裂解液中加入硫酸铵以去除杂质蛋白来获取包含所述蛋白的第一次纯化液；

d)、经Ni-NTA亲和层析处理所述第一次纯化液，通过至少一次咪唑溶液洗脱收集包含所述LEA蛋白的洗脱液。

2.根据权利要求1所述的分离纯化重组LEA蛋白的方法，其特征在于：

所述步骤a)具体为转化重组LEA-pET15b质粒并诱导表达获得包含所述LEA蛋白的大肠杆菌样品。

3.根据权利要求1所述的分离纯化重组LEA蛋白的方法，其特征在于：

在步骤b)中，提取重组蛋白质的蛋白抽提液的pH为8.0～8.4、Tris-HCl浓度为15～25mmol/L、NaCl浓度为10～100mmol/L、MgCl₂浓度为0.5～2.5mmol/L。

4.根据权利要求1所述的分离纯化重组LEA蛋白的方法，其特征在于，在步骤b)之后、步骤c)之前还包括如下步骤：

所述裂解液经过离心、去除沉淀步骤，加入30％硫酸铵沉淀杂质蛋白来获得包含所述LEA蛋白的粗提液。

5.根据权利要求1所述的分离纯化重组LEA蛋白的方法，其特征在于，在步骤c)之后、步骤d)之前还包括如下步骤：

向所述裂解液中加入60％硫酸铵，离心获取重组LEA蛋白的沉淀，沉淀加入溶液溶解获得所述LEA蛋白的第一次纯化液。

6.根据权利要求1所述的分离纯化重组LEA蛋白的方法，其特征在于：

在步骤d)中，首先将所述蛋白溶液结合Ni-NTA柱，然后用低浓度咪唑缓冲液洗脱两次，最后高浓度咪唑缓冲液进行洗脱并收集包含所述LEA蛋白的洗脱液；其中，所述低浓度咪唑缓冲液pH为8.0～8.4、Tris-HCl浓度为15～25mmol/L、NaCl浓度为50～200mmol/L、咪唑浓度为20～50mmol/L；洗脱缓冲液pH为8.0～8.4、Tris-HCl浓度为15～25mmol/L、NaCl浓度为50～200mmol/L、咪唑浓度为300～500mmol/L。

7.一种分离纯化重组LEA蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

用于提取重组蛋白质的蛋白抽提液：pH为8.0～8.4、Tris-HCl浓度为15～25mmol/L、NaCl浓度为10～100mmol/L、MgCl₂浓度为0.5～2.5mmol/L；

用于去除杂质蛋白的硫酸铵溶液：30％硫酸铵；

用于沉淀目标蛋白的硫酸铵溶液：60％硫酸铵；

用于Ni-NTA清洗层析柱的清洗缓冲液：pH为8.0～8.4、Tris-HCl浓度为15～25mmol/L、NaCl浓度为50～200mmol/L、咪唑浓度为20～50mmol/L；

以及用于洗脱层析柱的洗脱缓冲液：pH为8.0～8.4、Tris-HCl浓度为15～25mmol/L、NaCl浓度为50～200mmol/L、咪唑浓度为300～500mmol/L。