[发明专利]一种分离纯化重组LEA蛋白的方法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种分离纯化重组LEA蛋白的方法及试剂盒，本发明通过盐析去除杂蛋白、采用Ni‑NTA柱亲和层析分离纯化重组LEA蛋白，省去了复杂分子筛的纯化步骤，提高了制备效率，缩短了纯化时间，降低了制备成本。本发明大幅提高了LEA蛋白分离产量，并保持了LEA蛋白结构完整性以确保在应用中应有的蛋白活性。

技术领域

本发明涉及一种重组蛋白，涉及一种可溶性重组蛋白的分离纯化方法，具体涉及一种重组LEA蛋白的分离纯化方法。本发明还涉及一种分离纯化重组LEA蛋白的试剂盒。

背景技术

LEA蛋白(Late embryogenesis abundant protein)即胚胎发育后期丰富蛋白，主要作用是参与抵御逆境胁迫，保护逆境中的生物能够维持正常的生命代谢活动。LEA蛋白最早在棉花的子叶中发现，保护组织细胞在种子成熟过程中免受脱水给种子造成的伤害，随后在植物组织细胞、种子细胞和低等动物细胞中都发现LEA蛋白的表达。在干旱、高盐等逆境条件下，诱导产生的高亲水性蛋白保护细胞免受干旱、高盐等逆境的损伤。

研究者已经先后从棉花、大麦、拟南芥、西红柿和一些禾谷类等多种植物以及一些低等动物中克隆了lea基因，并进行了功能研究。LEA蛋白广泛存在于植物和低等生物钟，根据LEA蛋白序列所含有的保守基序，被分为LEA1～LEA6，以及Dehydrin和SMP，共8个家族。LEA蛋白的分子量大多在10KD-30KD之问，少量在30KD以上，其共同特点是富含亲水性的氨基酸，如色氨酸、苏氨酸、丝氨酸等。经大量研究发现，较高的亲水性和热稳定性是大部分LEA蛋白的共同特征。

LEA蛋白能够参与到作物抵御环境胁迫的过程当中，并在此中起到关键作用，这与其氨基酸构成及结构是密切相关的。LEA蛋白含有较高的极性氨基酸，使得其具有较强的亲水性；其次，LEA蛋白通常有保守的重复序列，这些序列在胁迫条件下可以形成高度螺旋折叠，这样的结构可能与某些变性蛋白的膜系统产生疏水作用，通过稳定脂膜或功能蛋白来阻止大量水分散失，从而降低外界环境给细胞内的代谢带来的影响；此外，溶解状态下LEA蛋白在随机构象和α-螺旋之间存在着一种动态平衡，这种动态平衡也是LEA蛋白能够参与作物抵御环境胁迫的原因之一。

以往LEA蛋白的纯化方法主要是使用液相色谱，通过离子交换层析柱和分子筛进行纯化，这种方法纯化LEA蛋白的过程复杂，LEA蛋白的制备效率低，也需要较长的纯化时间。

发明内容

本发明的目的提供一种步骤简化、制备效率高的分离纯化重组LEA蛋白的方法。

本发明所采用的技术方案如下：

一种分离纯化重组LEA蛋白的方法，包括如下步骤：

a)、将重组LEA质粒转化到Rosseta表达菌株，IPTG诱导目标蛋白表达；

b)、经细胞破碎处理所述的菌株样品并获得包含所述LEA蛋白的裂解液；

c)、向裂解液中加入硫酸铵以去除杂质蛋白来获取包含所述蛋白的第一次纯化液；

d)、经Ni-NTA亲和层析处理所述第一次纯化液，通过至少一次咪唑溶液洗脱收集包含所述LEA蛋白的洗脱液。

上述步骤a)具体为转化重组LEA-pET15b质粒并诱导表达获得包含所述LEA蛋白的大肠杆菌样品。

优选地，在步骤b)中，提取重组蛋白质的蛋白抽提液的pH为8.0～8.4、Tris-HCl浓度为15～25mmol/L、NaCl浓度为10～100mmol/L、MgCl₂浓度为0.5～2.5mmol/L。

在上述技术方案的基础上，在步骤b)之后、步骤c)之前还包括如下步骤：

所述裂解液经过离心、去除沉淀步骤，加入30％硫酸铵沉淀杂质蛋白来获得包含所述LEA蛋白的粗提液。