[发明专利]芋螺抗皱素的制备方法

说明书

本发明涉及多肽产品制备技术领域，特别涉及芋螺抗皱素的制备方法。本发明的所述方法采用固液相相结合的方法合成芋螺抗皱素产品。采用固相合成方法按照芋螺抗皱素主链从C端到N端依次偶联到树脂上，之后将肽从树脂上切割下来得到线性肽，然后采用自然氧化法将线性肽氧化得到三对二硫键的芋螺抗皱素粗肽环化液，粗肽环化液经纯化得到高纯度精肽。本发明所述工艺，以较简便的工艺步骤同时实现了在精肽质量和总收率方面的较高水平，与生物提取技术相比反应操作简单、工期短、成本低、收率高，容易达到产业化的要求，具有广泛的市场前景。

技术领域

本发明涉及多肽产品制备技术领域，特别涉及芋螺抗皱素的制备方法。

背景技术

芋螺抗皱素，英文名为mu-conotoxin，具体肽序如下：

H-Pyr 1-Gly 2-Cys 3-Cys 4-Asn 5-Gly 6-Pro 7-Lys 8-Gly 9-Cys 10-Ser11-Ser12-Lys 13-Trp 14-Cys 15-Arg 16-Asp 17-His 18-Ala 19-Arg 20-Cys 21-Cys22-CONH2(Disulfide Bridge:3-15,Disulfide Bridge:4-21；Disulfide Bridge:10-22)

芋螺抗皱素(mu-conotoxin)属于u-芋螺毒素家族，最开始从海洋蜗牛毒液分离得到，靶向多种电压敏感性钠通道，主要阻断Nav1.4通道。芋螺抗皱素可消除人面部上的表情皮肤皱纹，被用于化妆品领域。

芋螺抗皱素主链氨基酸有22个，其肽链较长且有三对二硫键形成其特定的空间立体结构。其特殊结构导致该产品目前只有文献报道其通过生物提取的方式得到，生物中含量极低，提取成本高；尚没有文献报道通过化学合成的方式得到高纯度的芋螺抗皱素产品。

如何通过化学合成的方法合成芋螺抗皱素线性肽，并根据芋螺抗皱素三对二硫键天然的稳定构象选择合适的缓冲盐体系及氧化浓度是工艺开发的重点。

发明内容

为了克服芋螺抗皱素目前只有生物提取获得的来源问题，本发明的目的在于：提供芋螺抗皱素制备工艺，本发明不仅合成周期短、总收率高、纯品纯度高，而且容易实现工业化放大生产。

其具体步骤如下：

步骤1：将固相载体依次与Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、H-Pyr-OH或其盐在碱或者缩合剂存在下进行缩合，得到全保护肽树脂。

步骤2：全保护肽树脂经裂解试剂裂解后，得到芋螺抗皱素线性肽；

步骤3：将芋螺抗皱素线性肽用DMSO水溶液溶解澄清后，加入到缓冲盐体系中，最终线性肽反应浓度控制在较稀浓度。室温下环化24～48小时，得到芋螺抗皱素粗肽环化液；

步骤4：粗肽环化液经纯化、浓缩、冷冻干燥，得到芋螺抗皱素。