[发明专利]一种多基因捕获测序方法

权利要求书

1.一种多基因捕获测序测序方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1 基因组DNA的提取和片段化

1.1准备试剂如下：QIAamp DNAMini试剂盒；

1.2基因组DNA的提取：用QIAamp DNAMini试剂盒对被检者组织进行提取；

1.3基因组DNA片段化，使用Covaris仪器，并按推荐操作流程进行操作，目标片段大小为200-300bp；

S2 准备Ligation master mix

2.1 将Ligation Buffer进行解冻处理，解冻后，剧烈震荡15s；

2.2 配制反应体系：在PCR管中加入Ligation Buffer和T4 DNA Ligase，配制完成后吹打混匀15~20次，短暂离心，在室温下放置30~45分钟；

S3 末端修复反应

3.1 将End Repair-A Tailing Buffer进行解冻处理，解冻后，剧烈震荡15s；

3.2 配制反应体系：在PCR管中加入End Repair-A Tailing Buffer和End Repair-ATailing Enzyme Mix，配制完成后吹打混匀15~20次，短暂离心；

3.3 取20μl End Repair/dA-Tailing master mix，加入50μl片段化的DNA中，吹打混匀15~20次，短暂离心；

3.4 将配制完成的反应体系置于PCR仪上，启动反应程序；

S4 P5-index连接反应

4.1 将Ligation master mix取25μl，加入到上一步的反应产物中，吹打混匀15~20次，短暂离心；

4.2 再加入5的SureSelect XT Low Input Dual Indexed Adaptor对应的P5端indexed Adaptor，吹打混匀15~20次，短暂离心

4.3 将配制完成的反应体系置于PCR仪上，启动反应程序

S5 纯化及分选

5.1 加60μl磁珠到上步连接产物中，轻轻吹打以保证整个体系均匀，室温静置5分钟

5.2 将离心管置于磁力架上分离磁珠和液体

5.3 保持离心管在磁力架上，待溶液澄清后（约5-10分钟），小心弃去上清，注意不要扰动磁珠

5.4 保持离心管在磁力架上，沿着管壁缓慢加入200μl新鲜配制的70%乙醇，注意加入乙醇时不要扰动磁珠，孵育30秒后小心移除上清

5.5 重复步骤5.4，共漂洗两次

5.6 用2-10μl移液器吸走所有残留乙醇，开盖在空气中干燥5-10分钟

5.7 磁珠晾干后，将离心管从磁力架上取下，加入105μl灭菌水覆盖磁珠，使用移液器吹打混匀磁珠，室温静置5分钟

5.8 将离心管短暂离心后置于磁力架上，待溶液澄清后，吸取上清100μl置于新的离心管中

5.9 加60μl磁珠到上步新离心管中，轻轻吹打混匀，室温静置5分钟

5.10 将离心管置于磁力架上分离磁珠和液体，待溶液澄清后，去上清155μl至新的离心管中

5.11 加20μl磁珠到上步新离心管中，轻轻吹打混匀，室温静置5分钟

5.12 将离心管置于磁力架上分离磁珠和液体

5.13 保持离心管在磁力架上，待溶液澄清后（约5-10分钟），小心弃去上清，注意不要扰动磁珠

5.14 保持离心管在磁力架上，沿着管壁缓慢加入200μl新鲜配制的70%乙醇，注意加入乙醇时不要扰动磁珠，孵育30秒后小心移除上清

5.15 重复步骤5.14，共漂洗两次

5.16 用2-10μl移液器吸走所有残留乙醇，开盖在空气中干燥5-10分钟

5.17 磁珠晾干后，将离心管从磁力架上取下，加入34.5μl灭菌水，使用移液器吹打混匀磁珠，室温静置5分钟

5.18 将离心管短暂离心后置于磁力架上，待溶液澄清后，吸取上清34.5μl置于新的离心管中

S6 扩增富集加P7端index

6.1 配制反应体系，在PCR管中加入5×Herculase II Reaction Buffer、100mM dNTPMix、Forward Primer和Herculase II Fusion DNA Polymerase，配制完成后吹打混匀15~20次，短暂离心

6.2 将将pre-capture PCR reaction mix、SureSelect XT Low Input IndexPrimer、纯化产物混合后吹打混匀15-20次，短暂离心

6.3将配制完成的反应体系置于PCR仪上，启动反应程序

S7 纯化扩增产物

7.1 加45μl磁珠到上步扩增产物中，轻轻吹打混匀以保证整个体系均匀，室温静置5分钟

7.2 将离心管置于磁力架上分离磁珠和液体

7.3 保持离心管在磁力架上，待溶液澄清后，小心弃去上清，注意不要扰动磁珠

7.4 保持离心管在磁力架上，沿着管壁缓慢加入200μl新鲜配制的70%乙醇，注意加入乙醇时不要扰动磁珠，孵育30秒后小心移除上清

7.5 重复步骤7.4，共漂洗两次

7.6 用2-10μl移液器吸走所有残留乙醇，开盖在空气中干燥5-10分钟

7.7 磁珠晾干后，将离心管从磁力架上取下，加入18μl灭菌水，使用移液器吹打混匀磁珠，室温静置5分钟

7.8 将离心管置于磁力架上分离磁珠和液体，待溶液澄清后，取18μl至新的离心管中

S8 杂交捕获

8.1 取文库产物，加入SureSelect XT HS and XT Low Input Blocker Mix，高速振荡5秒，短暂离心

8.2将配制完成的反应体系置于PCR仪上，启动反应程序

8.3 配制反应体系，在PCR管中加入Nuclease-free water、SureSelect FastHybridization Buffer、Capture Library≥3Mb和SureSelect RNase Block，配制的混合物为Capture Library Hybridization Mix

8.4 当8.2步骤的PCR程序运行至第3个步骤时，点击PAUSE，暂停程序，将13μl CaptureLibrary Hybridization Mix添加至PCR仪上的反应管中，吹打8-10次混匀，盖好盖子，点击Resume，使程序继续运行

8.5 准备T1磁珠（使用SureSelect Binding Buffer 清洗磁珠3次，并用200μlSureSelect Binding Buffer重悬磁珠）

8.6 当PCR程序运行至8.2第5个步骤时，快速将杂交产物转移至磁珠中，吹打5-8次混匀，在水平振荡仪中常温1500rpm振荡30分钟

8.7在8.6步骤期间，为每个样本准备6个孔的SureSelect Wash Buffer 2，每孔200μl，在PCR仪上70℃预热（带热盖）

8.8 振荡结束后，离心，放磁力架上弃上清，加入200μl SureSelect Wash Buffer 1，吹打混匀15-20次，放磁力架上弃上清

8.9 小心清除干净多余的SureSelect Wash Buffer 2，加入25μl水重悬，暂放于4℃冰箱

S9 杂交后扩增

9.1 配制反应体系，在PCR管中加入Nuclease-free water、5x Herculase IIReaction Buffer、Herculase II Fusion DNA Polymerase、100mM dNTP Mix和SureSelectPost-Capture Primer Mix，配制的混合物为post-capture PCR Reaction Mix

9.2 将25μl post-capture PCR Reaction Mix加入25μl上步产物中，吹打混匀15-20次，然后短暂离心

9.3将配制完成的反应体系置于PCR仪上，启动反应程序

9.4 下机后将PCR产物放在磁力架上，将上清转移至新的1.5ml离心管中，加入45μl磁珠，并使用70%乙醇，进行2步纯化，使用25μl水进行洗脱，定量准备上机。