[发明专利]一种多基因捕获测序方法

说明书

本发明公开了一种多基因捕获测序方法，该方法至少包括如下步骤：基因组DNA的提取和片段化、Ligation Master Mix的准备、末端修复反应、P5‑index连接反应、纯化及分选、扩增富集加P7端index、纯化扩增产物、杂交捕获、杂交后扩增。本发明选取的与人毛细管畸形相关的多个基因，包括AKT1、BRIP1、DDR2、FRG1B、MAP2K1、NOTCH2、PTCH1、SETD2、SDHD、ALK、C110RF30、DPYD、GATA3、MAP3K1、NRAS、PTEN、SF3B1、APC、CBFB、EGFR、GNA11、MDM2、NTRK1、RAD50、SMAD4、AR、CBL、EIF1AX、GNAQ、MED12、NTRK2、RAD51B、SMARCA4、ARID2、CDK4、ERBB2、GREM1、MLH1、PALB2、RAD51D、SPOP、ATM、CDK6、ESR1等，通过将基因捕获技术与高通量测序技术相结合，从而检测靶基因的所有变异类型，如突变、缺失、插入、融合等，从而准确快速达到检测用于肿瘤用药指导的基因变异的目的。

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域，尤其涉及一种用于多基因的捕获测序方法。

背景技术

肿瘤是机体在各种致瘤因素的作用下，局部组织的一些细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控导致异常增生与分化而形成的新生物。所以，从本质上说肿瘤是一种基因引起的疾病。近年来，以二代测序技术为基础的研究得到快速发展，能一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，可同步获得肿瘤患者个体特定样本中数以十亿计的DNA碱基序列信息，是发现已知和未知疾病相关基因变异的高效手段。因此，利用二代测序技术从基因水平上了解肿瘤患者其序列或结构的异常更有利于精准治疗。

2016年4月23日，中国临床肿瘤学会(CSCO)、中国肿瘤驱动基因分析联盟(CAGC)在北京发布《二代测序技术应用于临床肿瘤精准诊治的共识》，以及后续《实验室自建分子诊断项目基因要求专家共识》、《临床分子病理实验室二代基因测序检测专家共识》的出台给NGS用于临床肿瘤基因检测提供了公认的指导规范。基因检测作为肿瘤精准治疗的基础，为临床用药提供了科学的依据。

实体瘤是当前癌症中最具挑战的一类肿瘤，占据癌症约80%，源自上皮组织的实体瘤包括乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌和卵巢癌等。近年来利用二代测序技术的研究表明同一肿瘤类型，基因变异类型也可能不完全一致；不同肿瘤类型，基因变异类型也可能一致，因此从分子层面对肿瘤进行分型是实现肿瘤精准治疗的基础。开发用于实体瘤靶向用药指导的多基因检测方法就显得尤为重要，根据检测到的基因分型，制定最佳治疗方案，以最大化药物的利用价值，突破传统治疗的局限性，避免患者通过以身试药的方式选择有效方案，也避免了不适用药物带来的严重毒副作用，提升患者的生存期和生活质量。

发明内容

本发明提供了用于实体瘤靶向用药指导的多基因富集和检测方法。该方法利用多探针靶向捕获技术结合二代测序技术，用于富集和检测实体瘤中多个基因的变异情况，即以下基因的变异情况（如突变、缺失、插入、融合、拷贝数变化）：AKT1、BRIP1、DDR2、FRG1B、MAP2K1、NOTCH2、PTCH1、SETD2、SDHD、ALK、C110RF30、DPYD、GATA3、MAP3K1、NRAS、PTEN、SF3B1、APC、CBFB、EGFR、GNA11、MDM2、NTRK1、RAD50、SMAD4、AR、CBL、EIF1AX、GNAQ、MED12、NTRK2、RAD51B、SMARCA4、ARID2、CDK4、ERBB2、GREM1、MLH1、PALB2、RAD51D、SPOP、ATM、CDK6、ESR1等。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案。

S1 基因组DNA的提取和片段化。

1.1准备试剂如下：QIAamp DNAMini试剂盒。

1.2基因组DNA的提取：用QIAamp DNAMini试剂盒对被检者组织进行提取。