[发明专利]一种用于鉴定样品中幽门螺杆菌的细菌分型和耐药类型的二代测序建库方法

说明书

本发明公开了一种用于鉴定样品中幽门螺杆菌的细菌分型和耐药类型的二代测序建库方法，包括步骤S1，引物的设计和筛选，根据待测靶基因设计特异性引物；步骤S2，合成通用引物对；步骤S3，合成过渡性引物对；步骤S4，合成建库引物对；步骤S5，基因组的提取；步骤S6，在PCR扩增体系中加入所有的特异性引物对进行第一轮的多重扩增，回收产物并稀释，作为下一轮多重扩增的模板；步骤S7，在PCR扩增体系中加入通用引物对和所有的过渡性引物对进行第二轮的多重扩增，回收产物并稀释，作为下一轮多重扩增的模板；步骤S8，在PCR扩增体系中加入建库引物对进行第三轮的建库扩增，回收产物，获得制备完毕的文库；步骤S9，NGS靶基因测序；步骤S10，NGS分析。

技术领域

本发明涉及幽门螺杆菌的细菌分型和耐药类型测试分析领域，尤其涉及一种用于鉴定样品中幽门螺杆菌的细菌分型和耐药类型的二代测序建库方法。

背景技术

目前测序文库构建的方式主要有两种，一种是使用专门的试剂盒进行建库，一种是使用扩增子PCR的方式进行建库。其中，使用试剂盒进行建库的优点是标准化程度较高，适用性强，可针对各种长度的PCR产物；但缺点是试剂昂贵，操作流程比较繁琐。另外一种扩增子建库则简单、便宜许多，但是目前技术中，扩增子建库方法多为只针对一个单独的靶基因进行扩增建库，如果想对多个不同的靶基因进行一次性建库则需要一个个进行单基因扩增重复或者采用多重PCR，但是多重PCR建库方法前期优化实验复杂而且成功率很低，能扩增的靶基因数量上限也很少。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本发明的总体背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。

基于上述原因，本申请人提出了一种用于鉴定样品中幽门螺杆菌的细菌分型和耐药类型的二代测序建库方法，旨在克服上述问题，将常用的扩增子建库方案进行了升级，使其能够一次性的针对多个靶基因进行建库，降低了实验复杂度，简化了建库流程。

发明内容

为了满足上述要求，本发明的在于提供一种用于鉴定样品中幽门螺杆菌的细菌分型和耐药类型的二代测序建库方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种用于鉴定样品中幽门螺杆菌的细菌分型和耐药类型的二代测序建库方法，包括：

步骤S1，引物的设计和筛选，根据待测靶基因设计特异性引物；

步骤S2，合成通用引物对，所述通用引物对用于多重扩增体系中；

步骤S3，合成过渡性引物对，所述过渡性引物对包括通用引物序列与待测靶基因引物序列；

步骤S4，合成建库引物对，所述建库引物对包括Barcode测序引物序列与通用引物序列；

步骤S5，基因组的提取，提取样品中的细菌基因组；

步骤S6，第一次PCR处理，在PCR扩增体系中加入所有的特异性引物对进行第一轮的多重扩增，回收产物并稀释，作为下一轮多重扩增的模板；

步骤S7，第二次PCR处理，在PCR扩增体系中加入通用引物对和所有的过渡性引物对进行第二轮的多重扩增，回收产物并稀释，作为下一轮多重扩增的模板；

步骤S8，第三次PCR处理，在PCR扩增体系中加入建库引物对进行第三轮的建库扩增，回收产物，获得制备完毕的文库；其中，每份需执行建库扩增的样品对应一组含不同Barcode信息的建库引物；

步骤S9，NGS靶基因测序，使用测序SOP步骤对扩增子制备文库进行测序；

步骤S10，NGS分析，对样品中的靶基因序列进行分析。