[发明专利]一种限制性内切酶介导的引物自生成滚环扩增方法有效
| 申请号： | 201910752112.5 | 申请日： | 2019-08-15 |
| 公开（公告）号： | CN110484606B | 公开（公告）日： | 2022-07-22 |
| 发明（设计）人： | 梁兴国;安然;王晨儒;张伯颖;于姝婷 | 申请（专利权）人： | 中国海洋大学 |
| 主分类号： | C12Q1/6844 | 分类号： | C12Q1/6844 |
| 代理公司： | 青岛中天汇智知识产权代理有限公司 37241 | 代理人： | 刘晓娟 |
| 地址： | 266101 山*** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 限制性 内切酶介导 引物 生成 扩增 方法 | ||
1.一种限制性内切酶介导的引物自生成滚环扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将单链DNA在限制性内切酶的酶切位点进行硫代修饰；
2)将硫代修饰后的单链DNA进行环化，得到硫代修饰的单链环状DNA；
3)以步骤2)所得的硫代修饰的单链环状DNA为扩增模板，将扩增模板加入到含有待检测的目标DNA引物、具有链置换作用的DNA聚合酶和限制性内切酶的反应体系中进行多轮滚环扩增反应，目标DNA的分子信号被放大。
2.根据权利要求1所述的引物自生成滚环扩增方法，其特征在于，步骤2)中还包括通过Exo I对硫代修饰的单链环状DNA进行纯化的步骤。
3.根据权利要求1或2所述的引物自生成滚环扩增方法，其特征在于，步骤3)所述的反应体系中还包含0.01～1ng/μL的鲑鱼精DNA。
4.根据权利要求3所述的引物自生成滚环扩增方法，其特征在于，步骤2)中所述的环化采用T4 DNA Ligase splint辅助成环的方式。
5.根据权利要求4所述的引物自生成滚环扩增方法，其特征在于，所述辅助成环的splint的3’端含有磷酸基。
6.根据权利要求1、2或4所述的引物自生成滚环扩增方法，其特征在于，所述限制性内切酶是指II类限制性内切酶中的任意一种。
7.根据权利要求6所述的引物自生成滚环扩增方法，其特征在于，所述限制性内切酶是指TspRI、MboI、HinP1I、AluI中的任意一种。
8.根据权利要求1、2或4所述的引物自生成滚环扩增方法，其特征在于，所述DNA聚合酶为Phi29 DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、Vent(exo-)DNA聚合酶中的任意一种。
9.根据权利要求1、2或4所述的引物自生成滚环扩增方法，其特征在于，步骤1)中所述单链DNA的长度为30～90nt。
10.根据权利要求1、2或4所述的引物自生成滚环扩增方法，其特征在于，步骤3)中所述扩增模板的浓度为5～50nM，目标DNA引物的浓度为1～50nM。
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