[发明专利]一种限制性内切酶介导的引物自生成滚环扩增方法有效

专利信息
申请号: 201910752112.5 申请日: 2019-08-15
公开(公告)号: CN110484606B 公开(公告)日: 2022-07-22
发明(设计)人: 梁兴国;安然;王晨儒;张伯颖;于姝婷 申请(专利权)人: 中国海洋大学
主分类号: C12Q1/6844 分类号: C12Q1/6844
代理公司: 青岛中天汇智知识产权代理有限公司 37241 代理人: 刘晓娟
地址: 266101 山*** 国省代码: 山东;37
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摘要:
搜索关键词: 一种 限制性 内切酶介导 引物 生成 扩增 方法
【说明书】:

发明涉及一种限制性内切酶介导的引物自生成滚环扩增方法,包括如下步骤:1)将单链DNA在限制性内切酶的酶切位点进行硫代修饰;2)将硫代修饰后的单链DNA进行环化,得到硫代修饰的单链环状DNA;3)以步骤2)所得的硫代修饰的单链环状DNA为扩增模板,将扩增模板加入到含有待检测的目标DNA引物、具有链置换作用的DNA聚合酶和限制性内切酶的反应体系中进行多轮滚环扩增反应,目标DNA的分子信号被放大。本发明滚环扩增方法的有益效果是:1)利用限制性内切酶引发引物的自生成反应,构建出限制性内切酶介导的滚环扩增技术,可保证高扩增效率并拓宽其应用范围;操作简单、在恒温条件下即可实现核酸扩增反应。

技术领域

本发明涉及一种DNA的滚环扩增方法,尤其涉及一种采用限制性内切酶进行辅助切割反应,引发引物自生成的滚环扩增方法,能够实现核酸的快速高效扩增,属于核酸扩增技术领域。

背景技术

滚环扩增技术(Rolling circle amplification,RCA)起源于19世纪90年代,其灵感来自于自然界中病原微生物的复制,是通过具有链置换能力的聚合酶、一定量的引物和dNTPs,以环状DNA为模板进行复制的过程。该技术的出现,以其无需复杂的升降温程序,不受精密仪器需求的局限,并且具有特异性好、灵敏度高、操作简易的特点广泛应用于基因组扩增、生物、医疗诊断中。多年来,滚环扩增技术不断研究和改进,已开发了多种RCA技术。

常用的技术多为线性RCA、超分支滚环扩增(又称指数RCA)。但在不同程度上都受到一定程度上的限制,例如,线性RCA扩增与指数扩增相比效率较低;指数扩增虽然在扩增效率上明显提高,在足够的酶和原料存在下甚至可以达到106~109拷贝数,但不足之处在于需考虑两种引物序列的选择及设计,降低了实验设计的简便性。近年来,Murakami设计出引物自生成RCA(Primer Generation-Rolling Circle Amplification,PG-RCA),即在扩增过程中可以自身持续“制造”引物维持扩增的一种滚环扩增技术方法,该方法极大的扩大了RCA的应用范围。Murakami将这项技术配合特殊设计的3WJ探针用于检测RNA,并可以成功检测到几百甚至几十zM级别的RNA。又如Wang等人设计环形分子机器,并利用PG-RCA结合链置换扩增技术,实现了与癌症相关的K-ras和p53基因的检测,检测限可达到50pM。

PG-RCA技术与其他指数扩增相比,最大的优势在于无需额外引物的添加,避免了双重引物的复杂设计,从而简化扩增体系。其次这种自身产生引物的机制,更能检测可作为引物的靶标DNA,即使在引物浓度极低的条件下,仍能很好的实现信号放大作用。

但是在PG-RCA的过程中,只有切割双链DNA中的一条链才可以进行指数滚环扩增扩增;如果将双链DNA的两条链同时切割,则扩增无法继续进行。现有技术中是采用切刻内切酶来实现只切割双链DNA中的一条链的目的,而目前已开发且利用的切刻内切酶种类较少、在高温条件下容易变性失活、对反应温度有较严格的要求等方面的限制,使得该技术的实际推广受到了极大的限制,并在一定程度上限制了其应用范围。因此,亟待开发出一种应用更为广泛且兼具高灵敏度的核酸扩增方法。

发明内容

本发明针对现有的PG-RCA技术中使用的切刻内切酶存在的种类较少、在高温条件下容易变性失活、对反应温度有较严格的要求等方面的不足,提供一种限制性内切酶介导的引物自生成滚环扩增方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下:

一种限制性内切酶介导的引物自生成滚环扩增方法,包括如下步骤:

1)将单链DNA在限制性内切酶的酶切位点进行硫代修饰;

2)将硫代修饰后的单链DNA进行环化,得到硫代修饰的单链环状DNA;

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