[发明专利]一种酶催化的蛋白质C-端选择性酰肼化修饰方法

说明书

本发明公开了一种酶催化的蛋白质C‑端选择性酰肼化修饰方法。本发明提供了一种对蛋白质C端进行酰肼化修饰的方法，包括：在待修饰蛋白C末端连一个甘氨酸，经酶1(SEQ ID No.1)催化使其C末端酰胺化，经酶2(SEQ ID No.2)催化与亲核有机胺反应，从而完成对待修饰蛋白质的C端的酰肼化修饰。利用该方法可实现对蛋白质C端的酰肼化修饰，且为水相反应，条件温和，C‑末端选择性修饰，不影响侧链其他修饰基团，侧链无需保护，底物谱广，无底物蛋白质氨基酸序列限制。

技术领域

本发明涉及蛋白质修饰化学领域，具体涉及一种酶催化的蛋白质C-端选择性酰肼化修饰方法。

背景技术

蛋白的末端功能化对其生化性质具有非常重要的影响。通过对C端的特异性修饰可以使蛋白的体内代谢半衰期延长、免疫原性降低或毒副作用减少。而在蛋白的生化性质研究中，研究者往往需要将不同的功能化基团(例如，荧光基团、合成高分子或是免疫标记)添加到蛋白结构中。此外，高效准确的蛋白C端保护、去保护以及选择性活化方法，也是工业化蛋白合成生产中所迫切需要的技术。因此，蛋白的选择性C端修饰方法是当下生物活性大分子研究的热点领域，也是蛋白的工业化生产中急需解决的问题。

由于蛋白结构的复杂性，化学修饰步骤多、产率低、难度很大。而酶法修饰具有高度的位置和立体选择性、几乎不需要额外的侧链保护和去保护、无消旋化副反应，因此具有极大的优势。

发明内容

本发明的目的是提供一种酶催化的蛋白质C-端选择性酰肼化修饰方法。

第一方面，本发明要求保护一种对蛋白质C端进行酰肼化修饰的方法

本发明所要求保护的对蛋白质C端进行酰肼化修饰的方法，包括如下步骤：

(a1)在待修饰蛋白质的C末端连接一个甘氨酸；

(a2)步骤(a1)获得的连接有一个甘氨酸的待修饰蛋白质经酶1催化，反应后获得C末端被酰胺化的待修饰蛋白质；

(a3)步骤(a2)获得的C末端被酰胺化的待修饰蛋白质经酶2催化与带有修饰基团的亲核有机胺反应，从而完成对所述待修饰蛋白质的C端的酰肼化修饰。

所述酶1为氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质。

所述酶2为氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质。

所述带有修饰基团的酰肼化合物具体可为如下任一：

步骤(a1)可通过重组表达的方式实现在待修饰蛋白质的C末端连接一个甘氨酸。

步骤(a2)中，所述连接有一个甘氨酸的待修饰蛋白质经所述酶1催化，发生如下两步反应：第一步是对C-末端甘氨酸残基的羟基化；第二步是待修饰蛋白质C-末端的羟基甘氨酸进行自发脱乙醛酸化学反应形成C-末端酰胺化的待修饰蛋白质和乙醛酸盐。

进一步地，所述方法中，被修饰的蛋白质的C端氨基酸为脯氨酸外的其他19种组成生物体蛋白的氨基酸中的任一种(即甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸或组氨酸)。

进一步地，所述方法中，被修饰的蛋白质的C端氨基酸为C末端第1位氨基酸。

进一步地，在步骤(a2)和步骤(a3)中，均无需对所述待修饰蛋白质进行侧链保护。

进一步地，在步骤(a2)和步骤(a3)中，进行所述反应时的溶剂均为水。

进一步地，在步骤(a2)中，还包括向反应体系中加入抗坏血酸、CuSO₄和Bovinecatalase辅助所述酶1进行催化反应的步骤。