[发明专利]一种建立斑马鱼血管新生障碍模型的方法

说明书

本发明涉及一种建立斑马鱼血管新生障碍模型的方法，所述方法包括以下步骤：(1)斑马鱼的饲养；(2)斑马鱼血管新生障碍模型的建立；(3)评价辛伐他汀对斑马鱼血管新生的影响。本发明建立了一种既有在体实验的生物复杂性和高可信性，又有体外实验的高通量特性的筛选方法，造模成功率高、造模重复性强，用于中药促血管新生活性物质的筛选很有指导意义。

技术领域

本发明涉及基础医学领域，具体涉及一种建立斑马鱼血管新生障碍模型的方法。

背景技术

血管新生是在原有的毛细血管或者微静脉基础上，通过内皮细胞的增殖、分化和迁移，以芽生或非芽生的形式生成新生的血管，是血管“从少到多”的生物学过程，参与了很多的生理或病理过程。血管新生一方面促进缺血细胞释放一系列促进血管生成因子，诱导动脉生成，新生的动脉在已经阻塞或狭窄的冠状动脉周围，建立新的侧支循环，实现自我搭桥；另一方面促进毛细血管密度增加，改善灌注，从而增加缺血区域的血流，减少组织的损伤和坏死。血管新生为缺血性心脑血管疾病提供了新的治疗策略。

目前有多种方法用于检测药物的促血管新生活性，体外实验包括内皮细胞增殖实验^[1]，transwell/划痕迁移实验^[2，3]、管腔形成实验^[4]，鸡胚绒毛尿囊膜实验^[5]，小鼠主动脉环血管新生实验^[6]和视网膜血管新生实验^[7]；在体实验包括下肢缺血模型^[8]，急性心肌缺血模型(acute myocardial ischemia,AMI)^[9]和脑缺血模型(middle cerebral arteryocclusion,MCAO)^[10]等。但在体实验通量低，成本较高；而体外实验不能完全反映机体血管新生过程中的生物复杂性。

中国专利申请号CN20171024488.7，发明名称:藁本内酯在制备促进血管新生的药物中的用途，试验例1血管新生促进试验2.1.1斑马鱼血管新生障碍模型造模实验用VRI使用DMSO配制成10mg/ml的储备液，避光保存于4℃冰箱，临用时使用新鲜饲养水将其稀释至所需浓度。将受精后的斑马鱼卵放入24孔板中，加入适量新鲜饲养水；在鱼卵受精后24h，模型筛选组换液为含有300nM剂量VRI的新鲜饲养水1ml以抑制血管生成；3h后，换液为含藁本内酯的饲养水继续孵化21h。

但中国专利申请号CN20171024488.7存在以下缺陷：①是针对藁本内酯在制备促进血管新生的药物中的用途，并未明确公开辛伐他汀用于斑马鱼血管新生障碍模型的方法，因此辛伐他汀能否作为抑制斑马鱼血管新生的造模药物需要进一步研究；②并未明确孵育温度，因此造模成功率需进一步提高，实验结果重复性需要进一步增强；③未明确雄性斑马鱼:野生型雌性斑马鱼的配比，斑马鱼受精成功率较低；④未明确造模前斑马鱼的饲养方法，因此造模成功率需进一步增强；⑤未摸索出斑马鱼血管新生抑制率。

中国专利申请号CN201110327420.7用于筛选抗血管损伤药物的斑马鱼血管损伤模型及其建立方法和应用,一种斑马鱼血管损伤模型的建立方法，其特征在于包括以下顺序步骤：(1)取受精后24～28小时大的转基因或野生型的斑马鱼胚胎拆蛋壳后；(2)加入浓度为100～600nM/L的血管生长因子受体抑制剂，造模3-4小时；(3)清洗掉血管生长因子受体抑制剂，得到斑马鱼血管损伤模型。试验结果表明，该发明所建立的模式生物斑马鱼血管损伤模型，其造模率极高，可以模拟体内血管新生不足的环境进行快速筛选具有促血管新生类的药物，效果易于观察明显，在实验过程中用药量低，实验结果准确可重复性强。该模型可以成批量筛选潜在的药物，工作效率高。

但中国专利申请号CN201110327420.7存在以下缺陷：①并未明确公开辛伐他汀用于斑马鱼血管新生障碍模型的方法，因此辛伐他汀能否作为抑制斑马鱼血管新生的造模药物需要进一步研究；②并未明确孵育温度，因此造模成功率、重复性需要进一步增强；③未明确雄性斑马鱼:野生型雌性斑马鱼的配比，斑马鱼受精成功率较低；④未明确造模前斑马鱼的饲养方法，因此造模成功率需进一步增强；⑤未摸索出斑马鱼血管新生抑制率