[发明专利]一种提高酿酒酵母合成角鲨烯能力的方法

说明书

本发明提出了一种提高酿酒酵母合成角鲨烯能力的方法。该方法包括：将酿酒酵母HMG‑COA还原酶和角鲨烯合酶ERG9基因上调；以及GAL80和角鲨烯单加氧酶ERG1基因下调。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及酿酒酵母及其应用，更具体地，本发明涉及酿酒酵母及其应用，更具体地，本发明涉及酿酒酵母、提高酿酒酵母合成角鲨烯能力的方法以及获得角鲨烯的方法。

背景技术

角鲨烯(Squalene)是一种开链三萜类化合物，其化学名为：全反-2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-廿四碳六烯，可作为润滑剂、杀虫剂、衣物护理剂、药物载体、疫苗佐剂、皮肤保湿剂、抗氧化剂等。

天然角鲨烯的来源主要包括动物来源和植物来源。动物来源主要是从鲨鱼肝中提取，但此法破坏生态且产品中可能会携带动物致病因子；植物提取主要从橄榄油、大豆油、山茶油和米糠油中进行分离，但其产量低下，成本过高。微生物发酵是一直获取角鲨烯的新方法，一般的微生物发酵产角鲨烯的含量都较低，因此近年来有多个通过基因工程手段改造微生物的案例。

酿酒酵母作为生物安全性高的宿主菌，被很多研究用于进行改造生产角鲨烯。例如通过过表达HMG1的催化区域，可以将酿酒酵母中的角鲨烯含量提高大约40倍，达到大约到9mg/g干细胞(含量0.9％)《Polakowski,T.,U.Stahl,and C.Lang,Overexpression of acytosolic hydroxymethylglutaryl-CoA reductase leads to squalene accumulationin yeast.Appl Microbiol Biotechnol,1998.49(1):p.66-71.》。Rasool等人通过在酿酒酵母中多基因的过表达及基因的下调，其改造过后的酵母角鲨烯含量比野生型提高了76.16倍，但角鲨烯含量也仅有7.6mg/g干细胞(含量0.76％)。《Rasool,A.,M.S.Ahmed,andC.Li,Overproduction of squalene synergistically downregulates ethanolproduction in Saccharomyces cerevisiae. Chemical Engineering Science,2016.152:p.370-380.》。

因此，尽管研究者在不断努力提高微生物发酵产角鲨烯的含量，但这些产量离工业规模生产差距甚远。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

为了研发出一种比现存技术更有效和更廉宜的角鲨烯发酵方法，本发明通过遗传改造方法，对HMG1催化区域(tHMG1)及ERG9两个关键限速步骤进行过表达，同时进行 ERG1基因的下调表达，得到高产角鲨烯的工程菌。高产的角鲨烯菌可用于发酵提取角鲨烯，替代动物源角鲨烯，用于医药、化妆品领域。

为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种酿酒酵母。根据本发明的实施例，所述酿酒酵母包括：HMG-COA还原酶和角鲨烯合酶ERG9基因上调；以及GAL80和角鲨烯单加氧酶ERG1基因下调。根据本发明实施例的酿酒酵母，其中合成角鲨烯的合成酶ERG9 上调，角鲨烯转为下游产物的角鲨烯单加氧酶ERG1下调，实现了代谢产物角鲨烯的有效累积，同时，HMG-COA还原酶是甲羟戊酸途径中的限速步骤，它的上调也可实现萜类化合物角鲨烯产量的增加，GAL80的下调改变了酿酒酵母中的GAL调控系统，使得原本受到GAL80抑制的GAL1，GAL10，GAL7，GAL2启动子的转录活性不再受到抑制，从而使GAL1，GAL10，GAL7，GAL2启动子控制的基因强表达。根据本发明实施例的酿酒酵母具有高产角鲨烯的特点。

根据本发明的实施例，上述酿酒酵母还可以进一步具有如下附加技术特征至少之一：