[发明专利]一种产蔗糖磷酸化酶的基因工程菌

说明书

本发明公开了一种产蔗糖磷酸化酶的基因工程菌，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明将SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，以pET‑28a为载体构建重组质粒pET‑28a‑SPase，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，构建得到重组大肠杆菌，发酵产重组蔗糖磷酸化酶，得到高产蔗糖磷酸化酶的大肠杆菌菌株，其发酵胞内破壁上清酶活为504.19U/mL，比酶活为145.19U/mg，其稳定的产酶性可以为进一步的理论研究和实际生产应用打下基础，实践应用意义重大。

技术领域

本发明涉及一种产蔗糖磷酸化酶的基因工程菌，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

蔗糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7，Sucrose phosphorylase，以下简称SPase)主要能够催化两种类型反应：一种是以磷酸化的葡萄糖当作供体转移到不同的物质，如以D-果糖为受体合成蔗糖；另外的一种催化方式是把蔗糖磷酸化酶分解蔗糖得到的葡萄糖基转移至不同类型的受体，如无机磷酸，含酚羟基、醇羟基及羧基的物质，催化合成多种糖苷。

蔗糖磷酸化酶主要分布在细菌中。根据文献报道该酶主要存在于肠膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides、变异链球菌Stococcus mutans、嗜糖假单胞菌Pseudomonassaccharophila、长双歧杆菌Bifidobacterium longum、青春双歧杆菌Bifidobacteriumadolescentis 等微生物中。Leuconostoc mescnteroides可以合成蔗糖磷酸化酶[GoedlC.,Schwarz A.,Minain A.,et al.Recombinant sucrose phosphorylase fromLeuconostoc mesenteroides:Characterization,kinetic studies oftransglucosylation,and application of immobilised enzyme for production of d-glucose 1-phosphate[J].Journal of Biotechnol,2007,129(1):77-86.]。

目前，蔗糖磷酸化酶主要分布在细菌微生物中，植物细胞中有少量分布，该酶主要通过生物发酵获得，野生型菌株中的复杂代谢调控机制使得蔗糖磷酸化酶的产量较低，仅通过野生型菌株发酵生产蔗糖磷酸化酶，难以满足工业应用的要求。现有的通过构建基因工程菌来发酵生产蔗糖磷酸化酶，在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌中异源表达蔗糖磷酸化酶均有文献报道，但存在表达量不高，酶活力不高等问题。因此，提供一种酶活力高、稳定性好的蔗糖磷酸化酶工程菌株，对于其工业化生产有重要的应用价值。

发明内容

本发明第一个目的是提供一种产蔗糖磷酸化酶的基因工程菌，是将来源于Leuconostoc mesenteroides的蔗糖磷酸化酶的基因异源表达。所述编码蔗糖磷酸化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以pET系列质粒为载体，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以pET-28a质粒为载体。

本发明第二个目的是提供一种构建表达蔗糖磷酸化酶的重组大肠杆菌的方法，是将SEQ ID NO.2所示基因与载体连接，转化至大肠杆菌中。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。

在本发明的一种实施方式中，所述方法包括以下步骤：扩增SEQ ID NO.2所示的基因，酶切后，连接到载体pET-28a上，将重组质粒pET-28a-SPase转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布具有抗性的平板培养基，获得制备蔗糖磷酸化酶的工程菌。

本发明第三个目的是提供一种产蔗糖磷酸化酶的方法，是应用上述基因工程菌进行发酵。