[发明专利]一种阿维菌素菌种选育方法

说明书

本发明涉及一种阿维菌素菌种选育方法，该方法将阿维菌素孢子液稀释后经平面培养、斜面培养、种子培养、发酵培养得到高效价的单菌落并进行保种，平板培养基按质量百分比计，由以下组分组成：无水葡糖糖1‑5％、酵母浸粉0.1‑0.5％、磷酸氢二钾0.05‑0.5％、氯化钠0.3‑1.5％、琼脂1‑8％、余量为水；本发明的选育方法可以提高单菌落的孢子数量以及形态规则饱满的单菌落，与传统阿维菌种育种方法相比，大大的提高了得到高产菌的机率，提高筛选效率、节约筛选成本，平面培养基培养得到的阿维菌素单菌落孢子产量高，形态规则，呈火山状、草帽型。

技术领域

本发明涉及一种阿维菌素菌种选育方法，属于菌种选育领域。

背景技术

阿维菌素，英文名称Avermectins，是由日本北里大学大村智等和美国Merck公司首先开发的一类具有杀虫、杀螨、杀线虫活性的十六元大环内酯化合物，由链霉菌中灰色链霉菌Streptomyces avermitilis发酵产生，被行业人士称赞“青春永驻”的阿维菌素，目前已是全球用量最大、使用技术最成熟的农药品类之一。

目前，阿维菌素育种中，固体培养基多为琼脂，添加的氮源种类繁多，如酵母膏、牛肉膏、硫酸铵、豆饼花生饼粉等，但是这些氮源都不适合阿维菌素的单菌落生长，得到的阿维菌素单菌落孢子产量少，形态不规则，因此，目前的阿维菌素育种得到的单菌落状态严重影响了大批量育种的进度，甚至是暂停了育种的进度，随之阿维菌素市场容量越来越大，销售前景乐观。因此提高阿维菌素育种水平，提高经济效益，势在必行。

因此，有必要研发一种快速有效的阿维菌素菌种选育方法。

发明内容

针对现有的阿维菌素育种中，阿维菌素单菌落孢子产量少，形态不规则的缺陷，本发明提供一种阿维菌素菌种选育方法。

本发明的技术方案如下：

一种阿维菌素菌种选育方法，包括步骤如下：

(1)平面培养：将冻存的阿维菌素孢子液用无菌水稀释得到孢子悬浮液，将孢子悬浮液涂覆在平板培养基上，将平板培养基置于温度26-29℃的恒温条件下培养7-10天进行分离纯化，完成平面培养，

所述平板培养基按质量百分比计，由以下组分组成：无水葡糖糖1-5％、酵母浸粉0.1-0.5％、磷酸氢二钾0.05-0.5％、氯化钠0.3-1.5％、琼脂1-8％、余量为水；

(2)斜面培养：平面培养结束后在无菌室内挑选平板培养基上的阿维菌素单菌落，采用接种针将阿维菌素单菌落接种于斜面培养基上进行斜面培养；

(3)种子培养：将步骤(2)培养成熟的斜面菌种接于种子瓶培养基上，将种子瓶置于摇床上进行摇床培养，得到种子液；

(4)发酵培养：将种子液转接于发酵瓶培养基中，将发酵瓶置于摇床上进行摇床培养；

(5)单菌落效价测试：发酵培养结束后采用HPLC法测试单菌落效价，高效价者进行保种。

根据本发明优选的，步骤(1)中，孢子悬浮液的浓度为10^-1～10^-6。

根据本发明优选的，步骤(1)中，所述平板培养基按质量百分比计，由以下组分组成：无水葡糖糖1.5％、酵母浸粉0.25％、磷酸氢二钾0.1％、氯化钠0.6％、琼脂2％、余量为水，pH 7.2-7.4，121℃灭菌30min。

根据本发明优选的，所述的酵母浸粉总氮质量分数为10.56～11.32％、氨基氮质量分数为5.06～5.28％，氯化物质量分数为0.2～0.4％，磷酸盐和碱性沉淀实验无沉淀出现，色泽呈亮黄色。

根据本发明优选的，步骤(2)中，所述的斜面培养为将斜面培养基置于温度26-29℃的恒温条件下培养4-6天，完成斜面培养。