[发明专利]一种去除百日咳组分菌毛蛋白2/3内毒素的方法

说明书

本发明涉及生物制药技术领域，公开了一种去除百日咳组分菌毛蛋白2/3内毒素的方法。本方法将百日咳杆菌发酵培养后，离心收集菌体，菌体用尿素磷酸盐缓冲液抽提；离心收集上清，使用PEG‑8000和硫酸铵分别进行沉淀；沉淀使用磷酸盐缓冲液抽提，然后离心收集上清液，采用Q‑Sepharose层析柱处理，使用含氯化钠的磷酸盐缓冲液洗脱出Fim2/3组分。本发明联合PEG8000沉淀、硫酸铵沉淀和Q‑Sepharose层析柱处理三个操作，通过多重手段去除菌毛蛋白Fim2/3中的内毒素，可以在不带入外源物质的前提下，保持有效成分Fim2/3生物活性和回收率，同时将Fim2/3中的内毒素去除至10EU/mg以下。

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及一种去除百日咳组分菌毛蛋白2/3内毒素的方法。

背景技术

百日咳杆菌为卵圆形短小杆菌，属鲍特氏菌属，革兰氏染色阴性。专性需氧，初次分离培养时营养要求较高，需要在包姜培养基上培养才能生长。培养后，可见细小、光滑、凸起、不透明的菌落，周围有模糊的溶血环。与致病性有关的物质除荚膜、细胞壁脂多糖外，尚有多种生物学活性因子。百日咳外毒素是主要的致病因子，能诱发机体的持久免疫力，并有多种生物活性，如提高小鼠对组织胺、5～羟色胺的敏感性，促进白细胞增多，抑制巨噬细胞功能，损伤呼吸道纤毛上皮细胞导致阵发性痉挛咳嗽等。

国内无细胞百日咳疫苗的主要成分有PT、FHA。FIM2/3是百日咳杆菌的致病因子之一，研究证实FIM2/3在细菌感染过程中对宿主支气管细胞有粘附作用，目前世界上一些国家生产的无细胞百日咳疫苗中含有FIM2/3。

内毒素是多种革兰氏阴性菌的细胞壁成分，由菌体裂解后释出的毒素，又称之为“热原”。脂多糖，是热源的活性部分，含3个不同的化学区：包括内层的引起毒性反应的类脂A区、中层的核心寡糖区和外层的特异性多糖链区。内毒素相对分子质量从几千到几万不等，具有耐热性和化学稳定性，性质极不均一，很难找到一种高效且通用的内毒素去除方法，将其一次性彻底去除，有的甚至经过多个步骤处理后，仍然达不到要求。尤其在生物制品生产过程中，需要有严格的工艺控制，对内毒素进行限量控制。

百日咳杆菌的内毒素产生于百日咳杆菌的细胞外壁，是引起发热等疫苗副反应的主要物质，新的百日咳疫苗抗原纯化方法的改进使得内毒素的去除问题显现出来，百日咳组分生产中应尽量降低内毒素含量，以保证高质量的疫苗生产和使用。可以使用凝胶亲和等方法，来去除内毒素，实际使用时我们发现该方法虽然简易，只需在纯化过程中使用内毒素亲和胶，但是去除内毒素效果并不理想，而且容易引入亲和基团，影响疫苗的安全性。现有技术提供另一种FIM2/3的纯化方法（CN97197609.0），步骤相对繁琐，其包括前后两次超滤步骤及两次柱层析，分别为Sepharose CL6B及PEI硅胶柱，依据现有技术可知过多的纯化步骤可能造成更多目的蛋白损失。《欧洲药典》组分无细胞百日咳疫苗（aP）的内毒素要求为100EU/剂，未来国内的质量标准对内毒素的要求也不能低于该规定。

因此，急需一种工艺稳定、成本低、去除效果好、收率高，易于扩大生产的去除组分百日咳中的内毒素方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种去除百日咳组分菌毛蛋白2/3（Fimbrea2/3，Fim2/3）内毒素的方法，使得所述方法能够获得较高的Fim2/3回收率；

本发明的另外一个发明目的在于提供一种去除百日咳组分菌毛蛋白2/3内毒素的方法，使得所述方法去除Fim2/3内毒素的效果更高。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种去除百日咳组分菌毛蛋白2/3内毒素的方法，包括：

步骤1、将百日咳杆菌发酵培养后，离心收集菌体；

步骤2、所述菌体用含尿素的磷酸盐缓冲液抽提；