[发明专利]一种可区分污染的PCR阳性对照品的制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种PCR阳性对照品的制备方法，可以明显区分阳性对照品对核酸扩增体系的污染，提高PCR检测的准确性，降低假阳性。将PCR阳性片段的核酸序列从两个引物之间剔除一段序列，然后将其转化克隆工程菌，提取阳性质粒作为对照品，经改造的对照品不影响PCR引物的结合，也不影响PCR产物的扩增效率，而且由于片段长度小于正常阳性样本产物，所以在进行琼脂糖电泳的时候可以显著的区分开来，从而起到区别污染的作用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，提供一种核酸扩增体系的阳性对照品的制备方法，用该方法制备的对照品与正常样本同时进行PCR扩增，目的条带可以有效区分。

背景技术

PCR是一种极灵敏的核酸扩增技术，易受污染的影响。阳性对照品是主要污染源之一。由于拷贝数量极大，在PCR扩增时的开盖、摇动、吸样过程中与空气接触形成气溶胶体，散步在实验区域环境中，造成严重的污染现象，产生假阳性结果，严重干扰PCR检测的准确性。为了解决这一难题，国内外的研究者提出了许多种PCR防污染技术，其中物理隔绝法，紫外照射法，水解法以及加强对操作人员的标准化操作培训等方法在目前的PCR实验中普遍应用。虽然这些技术已被实践证明能有效控制污染，但是这些方法都是只是起到预防的作用，对于已经产生了污染，则无法准确的区分。

阳性对照品多采用经过纯化和规定浓度的阳性质粒、核酸扩增产物或者人工合成核酸片段，浓度高达10⁸拷贝/ul，因此在诊断试剂的研发和使用过程中阳性对照品对于正常样本的污染很难避免。

因此研究出一种可以区分污染的PCR阳性对照品，对于检测的可靠性具有重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明公开了一种PCR阳性对照品的制备方法，可以明显区分阳性对照品对核酸扩增体系的污染，提高PCR检测的准确性，降低假阳性。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种可区分污染的PCR阳性对照品，阳性对照品是通过将PCR阳性片段的核酸序列从两个引物之间剔除一段序列后获得，然后将序列克隆到T载体上，提取阳性质粒制备而成。

可选地，所述的PCR阳性对照品所剔除的核酸序列的位置可以是两个引物之间的任何位置，但剔除重组后不能形成错配，产生非特异性扩增片段。

可选地，所述的PCR阳性对照品所剔除的核酸序列的长度可以是两个引物之间的任意长度，但重组序列长度要符合PCR扩增的要求，同时满足电泳时可以与原片段区分大小。

本发明还公开了一种上述的PCR阳性对照品在所有普通PCR扩增反应中的应用。

本发明还公开了一种上述的PCR阳性对照品在所有普通PCR检测试剂盒中的应用。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1）本发明在普通PCR中的应用，电泳后可以一目了然的观察到是否有阳性质粒的污染存在，保证PCR检测的客观准确。

2）本发明阳性对照品的制备简单，核酸的合成、克隆以及质粒的提取都是阳性质粒的常规制备方法，不增加步骤，不增加成本。

3）本发明的适用面广泛，所有普通PCR方法都可以采用。

4） 本发明与其它PCR防污染的方法相对，操作简单，可以有效区分PCR扩增体系中是否存在阳性质粒的污染。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：