[发明专利]一种具有生物活性的多肽EEP2和二倍体的固相合成方法

权利要求书

1.一种生物活性多肽EEP2的制备方法，包括如下步骤：

1）以Fmoc-Leu-Wang 树脂为原料，采用Fmoc固相合成策略，以DIC/X为多肽偶联剂，将Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser（Y）-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH按EEP2的氨基酸排列序列依次进行连接；

2）去除N端Fmoc，与 Boc-Tyr（Y）-OH进行连接；

3）用裂解试剂切割肽树脂，切肽试剂为TFA/H₂O，过滤，滤液加入无水乙醚沉淀，离心后得到粗肽；

4）经制备型HPLC，采用C18柱进行分离纯化，冻干得到多肽EEP2；

5）采用质谱鉴定多肽EEP2。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：接肽反应温度维持在0~30℃，反应时间为1~4h。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：脱Fmoc反应温度在15~40℃，反应时间为0.5~2h。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：脱Fmoc试剂为Pip和DMF，其体积比为1：10~1：2。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：多肽偶联剂为DIC/X，其中X=HOAt、6-HOAt、HOBt、6-NO₂-HOBt、6-CF₃-HOBt、6-Cl-HOBt、HODhbt等。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：裂解肽树脂试剂为TFA的水溶液，其体积比（TFA：H₂O=1：1~10：1），室温反应0.5~2h，沉淀粗肽时无水乙醚体积为8~12倍，离心沉淀得到粗肽。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的Fmoc-Ser（Y）-OH、Boc-Tyr（Y）-OH的保护集团Y为Trt、OPmb、tBu、OMob、Aoc、Pbf等。

8.根据权利要求1所述纯化方法，其特征在于，流动相：V（0.1%TFA的乙腈溶液）：V水=2：8；流速为：10ml/min；检测波长为254nm，再经冻干得到白色终产物。

9.一种生物活性多肽EEP2二倍体的制备方法，包括如下步骤：

1）以Fmoc-Tyr（Y）-Ala-Ala-Pro-Pro-Ser（Y）-Pro-Pro-Leu-Wang树脂为原料，采用Fmoc固相合成策略，以DIC/X为多肽偶联剂，将Fmoc-Arg（Pbf）-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser（Y）-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH按EEP2的氨基酸排列序列依次进行连接；

2）去除N端Fmoc，与 Boc-Tyr（Y）-OH进行连接；

3）用裂解试剂切割肽树脂，切肽试剂为TFA/H₂O，过滤，滤液加入无水乙醚沉淀，离心后得到粗肽；

4）经制备型HPLC，采用C18柱进行分离纯化，冻干得到多肽EEP2；

5）采用质谱鉴定多肽EEP2。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：接肽反应温度维持在0~30℃，反应时间为1~4h。

11.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：脱Fmoc反应温度在15~40℃，反应时间为0.5~2h。

12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于：脱Fmoc试剂为Pip和DMF，其体积比为1：10~1：2。