[发明专利]一种具有生物活性的多肽EEP2和二倍体的固相合成方法

说明书

本发明公开了一种具有生物活性的多肽EEP2和二倍体的固相合成方法，即Tyr‑Ala‑Ala‑Pro‑Pro‑Ser‑Pro‑Pro‑Leu和Tyr‑Ala‑Ala‑Pro‑Pro‑Ser‑Pro‑Pro‑Leu‑Arg‑Arg‑Tyr‑Ala‑Ala‑Pro‑Pro‑Ser‑Pro‑Pro‑Leu的制备方法。采用此固相接肽合成方法，反应副产物少，纯化难度低，产量较高，反应操作简单，适合工业自动化生产。主要合成步骤：以Fmoc‑Leu‑Wang树脂为原料，将Fmoc‑Pro‑OH、Fmoc‑Ser（Y）‑OH、Fmoc‑Ala‑OH、Boc‑Tyr（Y）‑OH按EEP2的氨基酸排列序列依次进行连接，使用HPLC进行纯化，得到生物活性多肽EEP2。二倍体合成方法与EEP2合成策略相似，仅进行重复序列氨基酸依次连接。本发明操作简单，生产成本低，环境污染低，便于实施工业自动化生产。

技术领域

本发明涉及一种多肽EEP2和二倍体的制备方法，具体涉及多肽EEP2和二倍体的固相合成方法。

背景技术

EEP2是由9个氨基酸组成的多肽，结构式为：

EEP2是一种HLA-A2限制性ECM1特异性的CTL表位肽， 而EEP2二倍体是使用两个精氨酸将两个EEP2进行连接的CTL表位肽。两者均可与人HLA-A2分子的结合位点进行结合、可激活ECM1特异性的CTL细胞的表位肽，可用于研制靶向抗原ECM1的治疗性肽疫苗，该发现已申请中国发明专利，申请号201710050501.4；委托蛋白合成公司采用标准Fmoc方案，应用美国PE公司生产的ABI43IA型多肽合成仪进行多肽的合成，简述如下：按照多肽序列使肽链从羧基端向氨基端延伸，合成后，选用TFA/DCM进行切割，表位肽收集液在常温下减压干燥至1-2mL，然后用至少50 mL预冷乙醚沉淀，然后抽滤，得到的多肽粗产品。然而本课题组研究发现，本技术领域公知现有的标准Fmoc固相合成方法合成该多肽，存在合成副产物多、不易分离纯化、反应步骤多的问题。我们在标准的Fmoc合成策略上进行了改良，采用含有其他保护基的氨基酸原料进行合成，减少了反应步骤，提高了多肽的产率。

发明内容

本发明的目的在于提供具有生物活性的多肽EEP2及其二倍体的一种合成方法，解决了采用液相合成法产率低，反应操作复杂，生产周期长等问题；同时提供了一种反应条件温和，适合工业化生产多肽EEP2的固相合成方法。

本发明中一些常用的缩写具有以下含义：

Fmoc:芴甲氧羰基

Fmoc-AA：芴甲氧羰基保护的氨基酸

Boc：叔丁氧羰基

DIC：N，N’—二异丙基碳二亚胺

HOAt：1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑

6-HOAt：1-羟基-6-偶氮苯并三氮唑

HOBt：1-羟基苯并三唑

6-NO₂-HOBt：1-羟基6-硝基苯并三唑

6-CF₃-HOBt：1-羟基-6-三氟甲基苯并三唑

6-Cl-HOBt：6-氯-1-羟基苯并三唑

Pro：脯氨酸

Ser：丝氨酸

Leu：亮氨酸

Ala：丙氨酸

Tyr：酪氨酸

DMF：N，N-二甲基甲酰胺

DCM：二氯甲烷

MeOH：甲醇