[发明专利]一种聚乙二醇化重组粒细胞刺激因子PEG俢饰度的检测方法

说明书

本发明属于药物分析领域，涉及一种PEG俢饰度的检测方法，具体涉及一种聚乙二醇化重组粒细胞刺激因子的PEG俢饰度的检测方法。本发明以分子排阻色谱法和高效液相色谱法联合应用进行分析检测，本方法操作简单，测定结果准确，稳定性高，耐用性好，专属性高。

技术领域

本发明属于药物分析领域，涉及一种PEG俢饰度的检测方法，具体涉及一种聚乙二醇化重组粒细胞刺激因子的PEG俢饰度的检测方法。

背景技术

20世纪50年代末期，用化学修饰的方法研究蛋白质分子的结构和功能的关系称为生物化学和分子生物学领域的热点。蛋白质修饰的目的是用于生物医学和生物技术方面。在生物医学方面，化学修饰可以降低免疫原性的免疫反应性、抑制免疫球蛋白E的产生等；在生物技术领域，酶经过化学修饰后能够在有机溶剂中高效地发挥催化作用，并表现出新颖的催化性能。

蛋白质修饰剂与蛋白质发生反应的性质，主要可以分为四种类型：(1)酰化及其相关反应，这类修饰剂可以与蛋白质的侧链基团发生酰基化反应；(2)烷基化反应，这类修饰剂的特点是带有活泼的卤素原子，由于卤素原子的电负性，使烷基带有部分正电荷，很容易导致蛋白质分子的亲核基团发生烷基化；(3)氧化和还原反应，这类修饰剂具有氧化性，能将侧链基团氧化；(4)芳香环取代反应，蛋白质氨基酸残基的酚羟基在3和5位上很容易发生亲电取代的碘化和硝化反应。有代表性的修饰剂有乙酰咪唑、卤代乙酸、N-乙基马来酰亚胺碳化二亚胺、焦碳酸二乙酯、四硝基甲烷、N-卤代琥珀酰亚胺、乙二酸/丙二酸的共聚物、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯/顺丁烯二酰肼共聚物、多聚唾液酸、聚氨基酸、葡聚糖、环糊精、聚乙二醇(PEG)等。

其中，聚乙二醇(PEG)是一种线性、在溶液中可自由卷曲的不带电荷的聚合物，具有无毒、微弱的抗原性和良好的生物相容性。用它来共价修饰蛋白质，可以增加蛋白质的体内循环半衰期和减小其抗原性，增加蛋白质的溶解性并会改变蛋白质在人体内的生物学分布。自1977年Abuchowski，Davis(J.Biol.Chem.1977,252:3578-3581.)等人首次报道用PEG修饰蛋白质以来，PEG已经被广泛地应用于蛋白多肽类药物的修饰研究，蛋白质PEG化技术已经成为降低蛋白质生物药物的免疫原性、改善其药代动力学/药效学性质最有效的方法之一。由于蛋白质上可以发生PEG修饰的位点较多，因此，反映PEG对蛋白质修饰程度的平均修饰率或PEG结合数，对该类药物构效关系研究与质量控制具有重要意义。修饰蛋白药物的PEG结合数的检测方法有：三硝基苯磺酸法(TNBS法)、荧光胺法、核磁共振、毛细管电泳(CE)、基质辅助激光扫描系统(MALDI-MS)，傅里叶变换红外光谱(FTIR)、拉曼散射光谱等。

李晶等，荧光胺衍生物法测定3种聚乙二醇化重组人生长激素的平均修饰率，药物分析杂志，2014，34(8)，1368-1372；公开了一种通过对游离氨基进行荧光胺衍生化，测定三种不同结构聚乙二醇化重组人生长激素(PEG-rhGH)的平均修饰率，具体的为采用基质辅助激光解吸附飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定PEG-rhGH的相对分子质量，求得理论平均修饰率，通过激发波长与发射波长的选取、正交试验、游离PEG干扰试验、反应稳定性考察等方法学考察，建立荧光胺衍生法测定PEG-rhGH平均修饰率。

李永红等，聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子平均俢饰度高效液相色谱蒸发光散射检测方法的建立及验证，中国生物制品学杂质，2018年7月第31卷第7期，758-762；公开了一种高效液相蒸发光散射(HPLC-ELSD)检测方法，采用Jupiter 5u C4 300A色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，以含0.1％三氟乙酸(TFA)的水溶液为A流动相，含0.1％TFA的乙腈为B流动相，流速1mL/min，在35℃柱温条件下经分段线性洗脱的方式分离样品，蒸发光散射器漂移管温度90℃，载气流速2.0L/min，用外标法和双对数校正曲线定量溶液中游离PEG含量。采用蛋白酶K消化去除PEG-rhG-CSF的蛋白部分后，经相同方法测定溶液中的总PEG含量，并计算结合PEG的含量和PEG的平均俢饰度。